06月03 小麥Bax抑制劑-1蛋白（BI-1）與水通道蛋白TaPIP1相互作用增強(qiáng)擬南芥抗病性
隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，測(cè)序數(shù)據(jù)量呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，各類公共數(shù)據(jù)規(guī)模日益龐大，公共數(shù)據(jù)整合分析已逐漸成為很多研究中的一項(xiàng)重要分析手段。利用公共數(shù)據(jù)一方面可以降低研究成本，另一方面可以補(bǔ)充一些受限于研究者研究背景與技術(shù)水平而難以自主檢測(cè)的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。截至目前，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)SRA數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄超過(guò)10Pbase的NGS數(shù)據(jù)，但是由于公共數(shù)據(jù)整合分析過(guò)程中下載、存儲(chǔ)和分析各個(gè)環(huán)節(jié)都存在較高的技術(shù)門檻，導(dǎo)致研究者對(duì)公共數(shù)據(jù)的利用不充分。對(duì)于這些問(wèn)題百邁客已經(jīng)提供了非常成熟的解決方案，一鍵式導(dǎo)入即可完成數(shù)據(jù)的下載和存儲(chǔ)，輔以平臺(tái)上多達(dá)25個(gè)高度集成化的分析流程，可視化界面助您輕松搞定分析難題。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬有志老師課題組的徐兆師研究員等研究人員在百邁客云平臺(tái)結(jié)合公共數(shù)據(jù)完成擬南芥抗病性研究，成果于2018年1月22日發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》上，影響因子4.298。 摘要 Bax抑制劑-1（BI-1）是真核生物中進(jìn)化保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），定位細(xì)胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物脅迫的能力在擬南芥中得到了充分研究，而小麥中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在這項(xiàng)研究中，將禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥進(jìn)行RNA-seq分析，然后分離小麥BI-1基因TaBI-1.1。通過(guò)水楊酸（SA）處理誘導(dǎo)TaBI-1.1表達(dá)，并通過(guò)脫落酸（ABA）處理誘導(dǎo)TaBI-1.1的下調(diào)。基于β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色，TaBI-1.1在成熟葉和根中表達(dá)，但不在下胚軸或幼葉中表達(dá)。 TaBI-1.1在擬南芥中的組成型表達(dá)增強(qiáng)了其對(duì)丁香假單胞菌病毒（Pst）DC3000感染的抗性并誘導(dǎo)SA相關(guān)基因表達(dá)。此外，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥顯示出由高濃度SA引起的損害的減輕，并降低了對(duì)ABA的敏感性。與表型一致，35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析顯示TaBI-1.1參與生物脅迫。這些結(jié)果表明，TaBI-1.1正向調(diào)節(jié)SA信號(hào)并在對(duì)生物脅迫的響應(yīng)中起重要作用。此外，TaBI-1.1與水通道蛋白TaPIP1相互作用，并且它們都定位于ER膜（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜）。此外，研究人員證明了SA處理后TaPIP1上調(diào)，并且TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對(duì)Pst DC3000感染的抗性。由此表明，在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能發(fā)生在對(duì)SA信號(hào)和防御反應(yīng)的響應(yīng)中。 使用擬南芥Columbia-0（Col-0）作為TaBI-1.1過(guò)表達(dá)的背景， 突變體atbi1-2從擬南芥生物資源中心（ABRC）獲得。 從栽培的小麥品種小白麥擴(kuò)增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA， 將PCR產(chǎn)物克隆到pLB載體中，使用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同一性比較。 RNA-Seq Analysis 收集來(lái)自4周齡Col-0和轉(zhuǎn)基因系35S :: TaBI-1.1的葉片用于RNA-seq分析，使用HiSeq 2500平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)與TAIR 10擬南芥參考基因組比對(duì)。使用TopHat和Cufflink軟件包進(jìn)行mRNAseq數(shù)據(jù)分析以及DEG的鑒定和分析。通過(guò)GOseq軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO富集分析。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路進(jìn)行KEGG富集分析，尋找差異表達(dá)基因的富集通路。在百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）完成小麥Fg處理的RNA-seq數(shù)據(jù)下載和分析， SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：PRJNA289545）。 其他實(shí)驗(yàn)：1.qRT-PCR分析；2.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在脅迫處理下的應(yīng)答及性狀評(píng)價(jià)；3.β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）活性測(cè)定；4.細(xì)菌接種和細(xì)菌生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)；5.酵母雙雜交系統(tǒng)；6.Pull-Down assay（免疫沉淀法）；7.亞細(xì)胞定位測(cè)定；8.ELISA Assay（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)） 分析結(jié)果 1.通過(guò)qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色確定TaBI-1.1的表達(dá)模式 研究人員分析了來(lái)自Fg處理的小麥RNA-seq數(shù)據(jù)，以研究植物防御信號(hào)通路。從RNA-seq分析中分離出前10個(gè)差異表達(dá)基因。在這10個(gè)基因中鑒定了兩個(gè)小麥BI-1基因：TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名為TaBI-1。在小麥Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中僅篩選出三種BI-1基因：TaBI-1，TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在兩個(gè)差異表達(dá)的BI-1基因中， TaBI-1.1的差異最大。根據(jù)氨基酸比對(duì)，TaBI-1.1與TaBI-1同一性達(dá)到99.19％。與對(duì)照相比，F(xiàn)g處理對(duì)TaBI-1.1的表達(dá)水平上調(diào)24倍。許多關(guān)于AtBI-1的研究已經(jīng)證實(shí)AtBI-1在植物中對(duì)生物和非生物脅迫的抗性中起關(guān)鍵作用。 TaBI-1.1蛋白的序列與AtBI-1有69.88％的同一性，表明該序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR監(jiān)測(cè)TaBI-1.1的表達(dá)模式以確定TaBI-1.1在生物和非生物脅迫中可能的作用。TaBI-1.1的表達(dá)在響應(yīng)SA處理時(shí)顯著上調(diào)，在響應(yīng)ABA處理時(shí)下調(diào)。 SA處理48小時(shí)后TaBI-1.1表達(dá)達(dá)到8倍高峰（圖1A）。 響應(yīng)ABA處理的下調(diào)水平在8小時(shí)達(dá)到初始水平的約1/5（圖1C）。 響應(yīng)NaCl處理，表達(dá)水平在4小時(shí)后下降，在2小時(shí)稍微增加并且在8小時(shí)后回到其初始水平（圖1B）。 研究者創(chuàng)建了含有1.7kb TaBI-1.1啟動(dòng)子并生成轉(zhuǎn)基因擬南芥的PBI :: GUS融合構(gòu)建體，以研究TaBI-1.1的空間表達(dá)模式。使用GUS染色測(cè)定組織GUS活性。在成熟葉和根中有TaBI-1.1表達(dá)，但在下胚軸和幼葉中觀察不到（圖1D）。還檢測(cè)了各種小麥組織中的TaBI-1.1表達(dá)水平，包括根，莖，葉和小穗，結(jié)果表明TaBI-1.1的表達(dá)在這些小麥組織中普遍存在，而且在葉中最高，在小穗中最低（圖1I）。在SA和NaCl處理之后，成熟葉中的表達(dá)與對(duì)照相比增加，并且SA處理的表達(dá)更高。當(dāng)SA和NaCl處理時(shí)，在下胚軸中也檢測(cè)到表達(dá)（圖1E，F(xiàn)）。在ABA處理的植物的葉子中檢測(cè)到較弱的表達(dá)（圖1G）。通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)GUS表達(dá)水平（圖1H）。以上結(jié)果表明，TaBI-1.1在各種脅迫下均有表達(dá)。 圖1. 通過(guò)qRT-PCR和GUS染色評(píng)估TaBI-1.1的相應(yīng)表達(dá)模式 2.TaBI-1.1的表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對(duì)Pst DC3000感染的抗性 經(jīng)過(guò)Fg和SA處理后表達(dá)上調(diào)，假設(shè)TaBI-1.1可能參與生物脅迫反應(yīng)。研究人員在擬南芥中異位表達(dá)TaBI-1.1，在花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子的控制下驗(yàn)證這一假設(shè)。選擇兩個(gè)TaBI-1.1表達(dá)水平相對(duì)較高的純合株系3和7（35S :: TaBI-1.1＃1和35S :: TaBI-1.1＃2）用于進(jìn)一步分析（圖2A）。將atbi1-2，Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的四周齡葉子進(jìn)行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2處理（模擬物）。在模擬實(shí)驗(yàn)中，在用10mM MgCl 2處理3天后，在atbi1-2，Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的葉中沒(méi)有觀察到明顯差異（圖2B）。在用600nm（OD600）0.002的光密度接種Pst DC3000，3天后在這些葉中檢測(cè)到疾病癥狀。 atbi1-2突變體表現(xiàn)出的癥狀較嚴(yán)重，因?yàn)閹缀跛械娜~片都表現(xiàn)出嚴(yán)重的萎黃和壞死，而兩種轉(zhuǎn)基因品系表現(xiàn)出比atbi1-2和Col-0更輕微的疾病癥狀。轉(zhuǎn)基因植物的一小部分葉子是綠色的，沒(méi)有表現(xiàn)出萎黃和壞死。 Col-0葉中疾病癥狀的程度介于atbi1-2和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系之間（圖2C）。在接種Pst DC3000或10mM...
