10月31 【成功案例】通過全基因組Bisulfite測序技術(shù)研究羊卵巢DNA甲基化與生產(chǎn)力之間的關(guān)系
通過全基因組Bisulfite測序技術(shù)研究羊卵巢DNA甲基化與生產(chǎn)力之間的關(guān)系 雜志：BMC Genomics 影響因子：3.729 PMID：28969601 ? 背景 DNA甲基化是一種表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制，在生物學(xué)調(diào)控過程中起著重要的作用，比如基因表達(dá)、基因印記、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)生以及決定生物的表型和可塑性。甲基化發(fā)生在胞嘧啶殘基的CpG核苷酸上。目前，哺乳動(dòng)物中，通過高通量測序進(jìn)行全基因組甲基化探索重要的生物學(xué)功能的技術(shù)被廣泛應(yīng)用。對(duì)農(nóng)戶而言，羊的生產(chǎn)效率以及產(chǎn)仔次數(shù)是重要的經(jīng)濟(jì)回報(bào)指標(biāo)。通常情況下，生殖性狀的遺傳性在中等及以下，并且對(duì)表型選擇的效果并不顯著。因此，研究生殖能力相關(guān)的基因信息可以提高選擇效率。繁殖能力由卵巢濾泡調(diào)控，該過程被精確的增殖和分化事件調(diào)控。近期的研究主要集中在DNA甲基化如何調(diào)控卵巢的形成和生殖系統(tǒng)發(fā)育上。一些證據(jù)表明，卵巢的發(fā)育受DNA甲基化的調(diào)控。通過對(duì)豬的卵巢甲基化分析發(fā)現(xiàn)，在豬的性別和卵巢發(fā)育成熟過程中存在甲基化的改變。在山羊下丘腦甲基化研究中也存在類似的結(jié)果。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，但是想弄清楚DNA甲基化模式與生產(chǎn)力之間的關(guān)系仍然有局限。湖羊被公認(rèn)為生殖系統(tǒng)成熟早且生產(chǎn)能力強(qiáng)，然而，最近幾年的研究中，更多的注意力集中在肉質(zhì)上，選擇過程中關(guān)注生殖特征的研究相對(duì)較少。繁殖是一個(gè)復(fù)雜的過程，例如產(chǎn)仔數(shù)量這一特征受許多微效基因和一些主要基因的影響。所以了解DNA甲基化在基因功能中的作用非常必要。該研究中選用WGBS的技術(shù)對(duì)湖羊甲基化進(jìn)行研究，系統(tǒng)的分析了DNA甲基化模式與產(chǎn)仔數(shù)量的潛在關(guān)系。另外，此項(xiàng)研究也可以增加對(duì)湖羊甲基化的認(rèn)知和了解。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)材料：共選取6只湖羊（Hu sheep ），年齡3歲，非妊娠母羊，分為兩組： HP組（高生產(chǎn)力組）：3只湖羊，有3次產(chǎn)仔記錄（n=3，litter size=3） LP組（低生產(chǎn)力組）：3只湖羊，有1次產(chǎn)仔記錄（n=3，litter size=1） 分別將處于發(fā)情期的母羊在12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行屠殺，收集身體同側(cè)的卵巢，迅速用液氮冷凍， -80?°C儲(chǔ)存，分別提取DNA和RNA，DNA進(jìn)行bisulfite處理。 測序平臺(tái)：北京百邁客生物科技有限公司 IlluminaHiSeq 2500平臺(tái)，兩組分別選取3個(gè)樣本進(jìn)行WGBS測序，兩組總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序 分析平臺(tái)：所有數(shù)據(jù)在百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）進(jìn)行分析，分析內(nèi)容如下： 1.參考基因組比對(duì) 測序片段在進(jìn)行甲基化分析之前需要與參考基因組比對(duì)，通過bisulfite處理和PCR擴(kuò)增將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶（T）。應(yīng)用Bismark 軟件將bisulfite處理的片段與參考基因組（Oar_v3.1）比對(duì)，其他數(shù)值均選用百邁客云平臺(tái)的默認(rèn)參數(shù)。用該軟件進(jìn)行測序深度和覆蓋度的統(tǒng)計(jì)，以及bisulfite轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)，甲基化類型確定。Bismark 軟件不能辨別單個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，參數(shù)設(shè)置為coverage ≥ 4×，F(xiàn)DR< 0.05。 2.評(píng)估甲基化水平以及鑒定DMRs 使用MOABS軟件對(duì)覆蓋度大于10X的胞嘧啶位點(diǎn)進(jìn)行DMRs（差異甲基化區(qū)域）分析，運(yùn)用如下公式： 3.DMGs（差異甲基化基因）生物信息分析 將DMGs與GO,COG,KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析這些基因的功能，進(jìn)行GO富集分析，以及應(yīng)用KOBAS軟件對(duì)KEGG通路中顯著富集的差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測。并且利用String數(shù)據(jù)庫對(duì)選取的DMGs進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析。 結(jié)果 1.DNMTs表達(dá)水平 首先用qRT-PCR的方法分別對(duì)HP組和LP組卵巢中DNMTs（DNMT1, DNMT3A和?DNMT3B）表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)HP組中DNMT1和?DNMT3A的表達(dá)水平顯著低于LP組(P < 0.05)。 圖1.?HP組和LP組卵巢DNMTs的表達(dá)水平分析 2.DNA甲基化比對(duì)以及甲基化模式分析 HP組和LP組每個(gè)樣平均產(chǎn)生的clean數(shù)據(jù)分別是63.59G和66.72G。比對(duì)率在71.36%-74.68%之間。平均每個(gè)組中胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化率在3.5%左右。 表1.全基因甲基化測序結(jié)果 該研究中發(fā)現(xiàn)了3種甲基化的模式：CG，CHG(H 表示?A，C或?T), 和?CHH，這些類型在HP和LP兩個(gè)組的比例是非常相似的。HP組中：89.78% CG，?2.46% CHG，?7.76% CHH；LP組中：88.60% CG，2.66% CHG，8.74% CHH。 圖2.甲基化模式分析 3.甲基化序列偏好性分析 通過小提琴作圖分析，圖中不同的點(diǎn)代表不同的甲基化水平，且通過橫截面積可以看出CG甲基化類型的數(shù)量較多，而CHG和CHH甲基化類型的數(shù)量較低。通過各樣本染色體甲基化圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，染色體中大多數(shù)超甲基化胞嘧啶是CG類型的，并且不同組中染色體上的胞嘧啶甲基化位點(diǎn)有差異，如18號(hào)染色體。另外，研究者還分析了sequence context和甲基化偏好性之間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)了所有可能的9個(gè)堿基序列甲基化百分比，mC位點(diǎn)處于超甲基化狀態(tài)中，CAG是CHG甲基化位點(diǎn)中絕大多數(shù)共同序列motif，并且兩個(gè)組中CHH contexts的頻率不一樣。 圖3.各樣本甲基化分布小提琴圖 4.不同功能區(qū)域DNA甲基化水平 研究者將所有的mC分為啟動(dòng)子、5 ’UTR、外顯子、內(nèi)含子、3 ’UTR這幾個(gè)基因功能區(qū)域，通過這些功能區(qū)域?qū)谆竭M(jìn)行評(píng)估。兩組中，各區(qū)域表現(xiàn)出相似的甲基化水平，并且CG類型的甲基化水平高于CHG和CHH類型。mC的大部分位點(diǎn)發(fā)生在內(nèi)含子、外顯子（第一個(gè)外顯子除外）及下游區(qū)域。此外，在第一個(gè)外顯子中CG甲基化水平低于除上游區(qū)域以外的其他部分，上游區(qū)域的甲基化水平表現(xiàn)出下降的趨勢，TSS（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）附近的CG位點(diǎn)甲基化水平低于首個(gè)外顯子區(qū)域的甲基化水平。另外，在外顯子和內(nèi)含子中檢測到高度甲基化，并且這種甲基化水平從啟動(dòng)子區(qū)到TSS區(qū)逐漸下降，從TSS區(qū)到內(nèi)含子去逐漸增加。CHH類型是低甲基化一類并且在各功能區(qū)域較穩(wěn)定，CHG類型幾乎未甲基化。 圖4.CGI不同功能趨勢圖 5.CGI區(qū)域甲基化注釋 CGI（CG島）區(qū)域功能注釋發(fā)現(xiàn)，約68%超甲基化CGI分布在基因間區(qū)，1.5%的超甲基化CGI分布在UTR區(qū)，在兩個(gè)組中沒有顯著差異（P > 0.05）。 圖5. 不同功能部分CGI甲基化分布比例 6.HP組和LP組DMRs分析 檢測兩組DMRs以及根據(jù)不同的甲基化類型進(jìn)行基因功能注釋。共鑒定了70,899個(gè) CG 類型DMRs，?16 個(gè)CHG類型 DMRs以及356個(gè) CHH 類型DMRs。大多數(shù)在基因間區(qū)，5 ’ UTR 和?3 ’ UTR分別只有33和162個(gè)DMRs?；谒械募谆愋?，除基因間區(qū)外內(nèi)含子中DMRs的比例最高。研究人員還對(duì)兩組DMRs進(jìn)行了熱圖聚類分析。 圖6.不同基因功能區(qū)不同甲基化模式中DMRs比例 7.測序結(jié)果驗(yàn)證 為了驗(yàn)證測序結(jié)果，從測序結(jié)果中隨機(jī)選取10個(gè)DMGs進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示HP組中GPNMB，ELK4，?BACH1，?CDIPT表達(dá)水平顯著低于LP組，而SCYL1表達(dá)水平顯著高于LP組（P < 0.05），兩組中?ABCG2，mTOR，STK3，?ACVR1...
