12月12 【成功案例】云平臺助力解析單側(cè)眼組織缺損和視網(wǎng)膜裂癥的家族遺傳原因
Unraveling?the?genetic?cause?of?a?consanguineous?family?with?unilateral?coloboma?and?retinoschisis:?expanding?the?phenotypic?variability?of?RAX?mutations?
云平臺助力解析單側(cè)眼組織缺損和視網(wǎng)膜裂癥的家族遺傳原因
雜志：?Scientific?Reports?
影響因子：4.259
PMID:28831107
研究背景：
眼組織缺損（OC）是一種常見的發(fā)育結(jié)構(gòu)性缺陷，因視神經(jīng)不完全閉合發(fā)展而成。通常在虹膜、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜或視盤組織部分發(fā)生眼組織缺損。這一疾病進(jìn)程由多種基因突變引起，具有遺傳異質(zhì)性和復(fù)雜性。理解OC發(fā)病分子機(jī)制及基因型與表型相關(guān)性，對于OC的分子診斷具有重要意義。
近期云平臺助力溫州醫(yī)科大學(xué)黃秀峰老師在Scientific?Reports發(fā)表了一篇關(guān)于眼組織缺損致病性突變的研究，通過對OC患者及其家族成員進(jìn)行了全外顯子組測序（WES），純合子定位分析、全面變異分析，找到了血緣家族中單側(cè)眼組織缺損與視網(wǎng)膜裂癥的遺傳原因，闡述了OC基因型表型相關(guān)性。跟隨小編去看看吧。
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材料和方法：
材料：采集患者及其家族成員血液，提取DNA
測序平臺：Illumina?HiSeq?2000
分析平臺：BMKCloud，具體分析如下：
1.全基因組測序結(jié)果與人參考基因組進(jìn)行比對（SOAPaligner），篩選SNV和Indel（SOAPaligner、GATK?）
2.SNP陣列分析純合子定位
3.變異型分析
根據(jù)ExAC、NHLBI?ESP、1000 Genome、dbSNP137數(shù)據(jù)庫檢索，對致病變異型進(jìn)行初始篩選，并進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。評估候選變異型作用。分析錯義突變體（SIFT、Polyphen-2、MutationTaster）。預(yù)測每個候選變異型多肽的拓?fù)淠Ｐ停⊿MART、RaptorX、PyMol）另外進(jìn)行序列比對（Clustal?Omega），確定核苷酸保守性程度（PhyloP）
研究結(jié)果：
1.表型檢測
患者是一名14歲男性，攜帶常染色體隱性遺傳病，生于近緣家族，全面眼科檢查顯示其最近左眼視力逐漸喪失，雙眼出現(xiàn)輕微白內(nèi)障癥狀。眼前段裂隙燈檢查顯示右眼正常（圖1A），但左眼6點(diǎn)鐘方向虹膜缺損（圖1D）。眼底檢查右眼視神經(jīng)盤缺損（圖1B），左眼脈絡(luò)膜缺損（圖1E）。在視覺范圍上，右眼生理盲區(qū)擴(kuò)大（圖1C），雙眼視覺對比敏感度低（圖1C，F(xiàn)）。其他家庭成員沒有OC或眼部畸形。除OC表型外，眼底熒光血管造影（FFA）和光學(xué)相干斷層掃描（OCT）結(jié)果提示患雙側(cè)視網(wǎng)膜血管炎和繼發(fā)性視網(wǎng)膜劈裂癥（圖1G，H，K和L）。接受2個月激素治療后，雙眼黃斑水腫逐漸消失（圖1I和J）。
圖1?RAX基因突變患者臨床特征
2.WES及純合子定位分析表明RAX發(fā)生了突變
WES平均測序深度30X,平均覆蓋率＞95%.
變異型分析的詳細(xì)過程（圖2A）。變體數(shù)據(jù)庫中排除次要等位基因頻率（MAF）>0.005的變異型。純合子分析顯示有12個大于2?Mb的純合子位點(diǎn)（圖2B）。在使用逐步篩選策略后，發(fā)現(xiàn)在純合子區(qū)域有3個候選變異型（RAX、TRPM5、PCDH17）。在家族成員中擴(kuò)大檢測后篩選得到一個RAX錯義突變（c.113?T>?C，p.I38T）。且在dbSNP137、1000 Genome、ESP6500、內(nèi)部數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫中沒有此錯義突變（圖3A-B）。
純合子分析表明RAX基因位于18號染色體上較大的純合子區(qū)域（18.19?Mb）（圖2B）。?c.113?T>?C變異使疏水性異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性蘇氨酸。該家族中基因型與表型分離（圖3A，B）：患者父母是雜合子攜帶者，其健康的姐妹無此突變。在38位的異亮氨酸高度保守（圖3C），核苷酸位點(diǎn)c.113T>?C的PhyloP得分為2.986。表明RAX基因的純合子突變?c.113?T>?C是OC的病因。
圖2?變異分析流程及純合子分析圖譜
圖3?RAX突變鑒定（A.譜系遺傳;B.Sanger驗(yàn)證;C.RAX基因?Ile38?氨基酸殘基進(jìn)化保守性）
3.RAX突變比較分析和結(jié)構(gòu)分析
患者在RAX基因的兩個等位基因的exon1內(nèi)有突變（圖4A）。RAX?c.113?T?>?C突變導(dǎo)致38位的氨基酸錯義突變，氨基酸I38位于八肽模體中，生信分析預(yù)測顯示I38T錯義突變具有破壞性（SIFT得分：0;?MutationTaster得分：1），可能對蛋白質(zhì)，視網(wǎng)膜和前神經(jīng)折疊同源序列造成損害（PolyPhen2得分：0.873）。子域識別結(jié)果表明這個突變不在同源序列、配對序列中（SMART）。對RAX進(jìn)行潛在功能分析（RaptorX，PyMol），構(gòu)建結(jié)構(gòu)模型（圖4B），結(jié)合遺傳分析及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，我們推測序列改變增加了I38殘基的螺旋構(gòu)象，從而使RAX蛋白空間結(jié)構(gòu)改變。
圖4?RAX基因突變結(jié)構(gòu)分析
結(jié)果：
在本研究中，我們對UC和視網(wǎng)膜裂癥患者及其家庭成員進(jìn)行了分子遺傳學(xué)檢測。利用全外顯子組測序和純合性定位組合方法，篩選后得到唯一候選致病基因RAX致病突變（c.113?T>?C，p.I38T）。結(jié)果得到臨床、功能模型數(shù)據(jù)的支持。本研究擴(kuò)大了對RAX突變表型變異性的理解，有利于進(jìn)一步理解OC發(fā)病分子機(jī)制及基因型表型相關(guān)性。
創(chuàng)新點(diǎn)：
本研究不僅證明了WES和純合子繪圖是解析遺傳異質(zhì)性疾病患者致病性突變的有用工具，也有助于進(jìn)一步闡明OC疾病發(fā)病分子機(jī)制及基因型表型相關(guān)性。
參考文獻(xiàn)：Huang?X?F,?Huang?Z?Q,?Lin?D,?et?al.?Unraveling?the?genetic?cause?of?a?consanguineous?family?with?unilateral?coloboma?and?retinoschisis:?expanding?the?phenotypic?variability?of?RAX?mutations.[J].?Sci?Rep,?2017,?7(1).