09月01 【成功案例】百邁客云全面解析水稻抗旱分子機制
植物抗旱研究的老師看過來了，近期華中農(nóng)業(yè)大學水稻研究團隊成功構(gòu)建水稻雙基因轉(zhuǎn)化抗旱株，并借助百邁客云計算平臺（www.dustyhill.net）挖掘該抗旱株轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，完成對該新型水稻抗旱株抗旱機制初步探究。
中文題目：OsbZIP46、SAPK6基因共同過表達提升水稻抗旱能力
IF = 4.298 ? ? ? ? ? ? ? ? ?PMID:28694815
干旱是全世界范圍內(nèi)威脅水稻產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一。作物的抗旱性狀一般認為由多基因控制，因此，抗旱相關(guān)多基因轉(zhuǎn)化策略理論上可以作為提高水稻抗旱性的一種有效手段。
脫落酸（abscisic acid,ABA）信號通路在植物非生物脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置，該通路包含4個主要組件：a）ABA 受體PYR/PYL/PCAR，b）A型蛋白磷酸酶2C，c）蛋白激酶SnPK2，d）bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族（第3亞家族）。之前研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子活性在多種植物中可被蛋白磷酸酶SnPK2s通過磷酸化調(diào)節(jié)。我們之前的研究也表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP23和OsbZIP46在水稻抗旱過程中扮演著重要角色，且其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性可被SnPKs家族SAPK2與SAPK6激活。因此，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族與SAPKS蛋白磷酸酶家族可作為多基因轉(zhuǎn)化策略中的候選基因來提升水稻抗旱能力。
技術(shù)路線
材料
轉(zhuǎn)化基因：OsbZIP46CA1（bZIP轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP46刪除負調(diào)控domainD）+ SAPK6（蛋白磷酸酶家族）；
轉(zhuǎn)化載體：pCB2004質(zhì)粒
水稻轉(zhuǎn)化受體材料 ： 東北種植品質(zhì)KY131
水稻轉(zhuǎn)基因材料：XL22（OsbZIP46CA1+SAPK6），CA1-OE（OsbZIP46CA1），SAPK6-OE（SAPK6）
RNA-seq材料：XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N4葉齡種子材料，每個處理3個生物學重復(fù)
方法
轉(zhuǎn)化：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化
插入片段拷貝數(shù)檢測：Southern Blot
插入基因轉(zhuǎn)錄水平評估：熒光定量PCR
插入基因蛋白表達及活性評估：熒光定量PCR檢測OsbZIP46CA1調(diào)控基因Rab21、 Rab16B在轉(zhuǎn)基因材料中的轉(zhuǎn)錄水平；轉(zhuǎn)基因材料對ABA敏感性判斷轉(zhuǎn)化基因是否正常過蛋白過表達且產(chǎn)生活性
抗旱性評估： 種子發(fā)育期，缺水處理7天，恢復(fù)給水7天后存活率；生殖生長期，孕穗期缺水處理14天，產(chǎn)量、灌漿速率、穗數(shù)、小穗花數(shù)等指標
RNA-seq測序：Hiseq測序平臺，百邁客云（www.dustyhill.net）數(shù)據(jù)分析平臺
1、轉(zhuǎn)化株構(gòu)建與篩選
1）使用MISSA系統(tǒng)構(gòu)建pCB2004+OsbZIP46CA1+SAPK6重組質(zhì)粒，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法將兩個抗旱相關(guān)目標基因插入東北栽培品種水稻KY131基因中，構(gòu)建OsbZIP46CA1、APK6雙基因轉(zhuǎn)化株。另外，也使用同樣的轉(zhuǎn)化體系分別構(gòu)建了上述兩個基因的單基因轉(zhuǎn)化株。
2）通過southern-blot雜交技術(shù)，鑒定T0初始轉(zhuǎn)化株中插入基因的拷貝數(shù)，挑選插入基因單拷貝的T0的T1子代初步鑒定具備抗旱性狀的轉(zhuǎn)基因株（肉眼觀察）。
3）最終篩選得到一個在生殖器官發(fā)育階段抗旱強于非轉(zhuǎn)基因株的雙基因轉(zhuǎn)化株XL22，見圖1B。
4）利用熒光定量PCR技術(shù)，檢查了XL22轉(zhuǎn)基因株及其對應(yīng)的單基因轉(zhuǎn)化株中的插入基因是否過表達，如圖1C所示，上述轉(zhuǎn)化株中插入基因均出現(xiàn)了預(yù)期的轉(zhuǎn)錄水平。
5）以O(shè)sbZIP46CA1的下游調(diào)控基因Rab21、Rab16B的轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)化株對ABA的敏感性來判斷插入基因是否發(fā)揮作用，如圖1C所示，轉(zhuǎn)化株中點的Rab21、 Rab16B轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)上調(diào)，且轉(zhuǎn)化株對ABA更加敏感，說明上述轉(zhuǎn)化株中的插入基因均能正常發(fā)揮作用。
2、XL22轉(zhuǎn)化株抗旱能力評估
a）生殖生長期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉(zhuǎn)化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉(zhuǎn)化株）、KY-131-N（非轉(zhuǎn)基因株）4組材料，每組4個獨立生物學重復(fù)，孕穗期缺水處理14天，比較不同材料之間的單株產(chǎn)量、灌漿速率、穗數(shù)、小穗花數(shù)、圓錐花序數(shù)、單位面積產(chǎn)量6個指標。如圖3所示，無論是肉眼觀察（3A、3B）結(jié)果，還是上述6個指標（3C）統(tǒng)計結(jié)果，都表明XL22在抗旱性上要優(yōu)于單基因轉(zhuǎn)化株與非轉(zhuǎn)基因株。
b）種子發(fā)育期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉(zhuǎn)化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉(zhuǎn)化株）3組材料（4葉齡），每組3個生物學重復(fù)，7天缺水處理，觀察恢復(fù)給水7天后的葉片卷曲情況，統(tǒng)計存活率。如圖4A所所示，恢復(fù)給水7天后，XL22相較于單基因轉(zhuǎn)化株，葉卷曲更加輕微，如圖B所示，XL22的存活率也要顯著高于單基因轉(zhuǎn)化株。另外，如圖4所示，XL22離體葉片子在室內(nèi)環(huán)境下，脫水速度也顯著低于其他材料。該結(jié)果表明，XL22在種子發(fā)育階段的抗旱能力也要強于單基因轉(zhuǎn)化株。
3、XL22轉(zhuǎn)化株耐熱、抗寒能力評估
分別取XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N的4葉齡種子材料，每個3個生物學重復(fù)，均進行42℃ 12小時，4℃5天處理，最后正常環(huán)境下生長7天，觀察這各材料之間的葉卷曲清苦以及存活率，結(jié)果顯示，XL22表現(xiàn)為個更高的存活率（圖5C)，更加輕微的葉片卷曲（圖4A），表明XL22相較于單基因轉(zhuǎn)化株與非轉(zhuǎn)基因株擁有更強的耐熱、抗寒能力。
4、RNA-seq揭示XL22抗旱分子學機制
a）為了分析XL22抗旱表型后的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究者分別對XL22、 CA1-OE、SAPK6-OE 3個轉(zhuǎn)化株系在正常給水與相同缺水處理條件下的材料進行了轉(zhuǎn)錄組測序，取樣部位為倒二葉，每個處理設(shè)置兩個生物重復(fù)，測序使用illumina Hiseq平臺，PE150讀取方式，數(shù)據(jù)分析在百邁客云計算平臺（www.dustyhill.net）完成。
b）分析結(jié)果顯示，XL22的缺水處理相較于正常給水組材料，2977個基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，3243個顯著下調(diào)；CA1-OE中，2962個基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)， 3514個基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)；SAPK6-OE中，3433個基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，3472個基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)（FDR < 0.01, |FC| > 2）。大部分的轉(zhuǎn)錄上調(diào)基因在3個材料之間是共有的，如圖6B所示，表明這些上調(diào)基因在水稻干旱脅迫響應(yīng)中功能比較保守。
c）由于轉(zhuǎn)基因材料中過表達基因為bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子及其活性激活基因家族，研究者重點關(guān)注了3個材料中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因，這些基因被劃分為4類：Group1，XL22相較于CA1-OE特有上調(diào)基因，645個；Group2,XL22相較于SAPK6-OE特有上調(diào)基因，500個基因特異上調(diào)；Group3，CA1-OE相較于SAPK6-OE特有上調(diào)基因，398個；Group4，SAPK6-OE相較于CA1-OE特有上調(diào)基因，869個。Group I主要分布在“Response to ABA”、“Regulation of Plant-type Hypersensitive response”等GO term；Group II主要分布在“Organic Substance Biosynthetic Process” 、“Salicylic Acid Biosynthetic Process” 、“Regulation of Hydrogen Peroxide Metabolic Process”等GO term；Group3主要分布在“Gene Expression and Regulation”、 “Nitrate Related Metabolic Process” 、 “Carbohydrate Biosynthetic Process” 等GO term；Group4主要分布在 “Cytokinesis and Cell Proliferation”、“Microtubule Related Process”、“Response to Abiotic Stress” 等GOterm（見圖6C）。因此推測，XL22中的兩個基因可能激活了不同的干旱脅迫應(yīng)答基因。
d）為了揭示GroupI 、Group2兩個基因集內(nèi)部的基因調(diào)控關(guān)系，研究者基于STRING數(shù)據(jù)庫分別繪制了上述兩個基因集內(nèi)部基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。如圖7所示，GroupI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中包含481個PPI（protein-protein intereaction，PPI），Group2中包含280個PPI。其中，有6個基因在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中均處于非常中心的位置（與之互作蛋白數(shù)量越多，越靠近中心位置）。其中，3個（LOC_Os12g13720, ?LOC_Os03g58800, ?LOC_Os09g31486) 在兩個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中均處于中心位置，分別編碼 PDR ABC transporter, a ATPase, and a DnaK/Hsp70s family protein,可能在干旱應(yīng)答過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮著非常關(guān)鍵的；其他3個基因（Group1特異：LOC_Os04g42260 ?LOC_Os02g38580，Group2特異：LOC_Os05g03050）分別編碼protein phosphatase、Rad51、Hsp90 ，從功能可以看出，它們與水稻干旱應(yīng)答同樣相關(guān)。
- 構(gòu)建了抗旱OsbZIP46CA1+SAPK6雙基因轉(zhuǎn)化水稻XL22。
- 揭示了XL22抗旱表型后部分分子調(diào)控機制，為之后進一步的分析調(diào)控機制研究提供參考信息。
研究中涉及到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，從下機數(shù)據(jù)質(zhì)控、與參考基因組比對，到基因轉(zhuǎn)錄水平定量、差異表達分析，到最后共表達分析、蛋白互作分析，均是該實驗室的同學們在百邁客云平臺的有參轉(zhuǎn)錄組APP提供的圖形化界面下自主完成的，該步操作無需編程語言基礎(chǔ)，無需linux系統(tǒng)命令行界面下軟件安裝、調(diào)試與運行經(jīng)驗，更重好的是無需等待，基礎(chǔ)分析7天完成，個性化分析幾分鐘人機交互完成1次，你要做的只是網(wǎng)頁下簡單幾步便可完成數(shù)據(jù)導(dǎo)入、參數(shù)設(shè)定、任務(wù)運行、結(jié)果查看、數(shù)據(jù)后期挖掘等數(shù)據(jù)分析步驟。