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11月29

發(fā)布于 14:20 最新文章, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

云平臺(tái)深度解析-小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在侵染初始階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化 Transcriptional responses of wheat?and the cereal cyst nematode?Heterodera?avenae during their?early contact stage 小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在侵染初始階段的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng) 雜志：?Scientific Reports? 影響因子：4.259 PMID:29101332   研究背景： 植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)（PPNs）已給許多植物帶來(lái)了巨大損害。禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)Wollenweber隸屬禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)（CCNS），出現(xiàn)在80％的中國(guó)小麥種植區(qū)，致使小麥感染并減產(chǎn)30％到100％。許多寄生線(xiàn)蟲(chóng)可繁殖幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)用感官定位宿主，這種復(fù)雜的行為與感官能力（如嗅覺(jué)、味覺(jué)、溫濕度感應(yīng)）有關(guān)。可在植物根部與線(xiàn)蟲(chóng)初始接觸過(guò)程中采取措施進(jìn)行預(yù)防，因此了解寄生蟲(chóng)宿主互作機(jī)制具有重要意義。過(guò)去大部分研究集中在線(xiàn)蟲(chóng)侵染宿主后不同階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，而沒(méi)有關(guān)于侵染前（早期接觸階段）互作機(jī)制的探討。今年11月3日中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的老師們?cè)赟cientific Reports 發(fā)表了一篇關(guān)于小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在接觸早期轉(zhuǎn)錄響應(yīng)機(jī)制的研究，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外研究空白，第一次對(duì)小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)互作早期轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)性的描述。   材料和方法 實(shí)驗(yàn)組：Wenmai19小麥幼苗（根長(zhǎng)2–3 cm ）與J2s；對(duì)照組：僅Wenmai 19小麥幼苗或僅J2s。 處理3h后提取RNA測(cè)序。實(shí)驗(yàn)組小麥根尖染色鏡檢。每組三個(gè)重復(fù)。測(cè)序后分別對(duì)小麥和線(xiàn)蟲(chóng)DEGs進(jìn)行了鑒定注釋?zhuān)?duì)線(xiàn)蟲(chóng)的效應(yīng)基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)及BT-PCD驗(yàn)證。 測(cè)序平臺(tái)：百邁客HiSeq4000測(cè)序平臺(tái) 分析平臺(tái)：百邁客云平臺(tái)（BMKCloud） 研究結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)錄組分析采樣時(shí)間點(diǎn)確定 CCN易感小麥品種Wenmai19吸引禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)J2s。小麥根尖周?chē)奂腏2線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量在3h達(dá)到峰值，且J2s未滲入根內(nèi)部。選擇此時(shí)小麥根、線(xiàn)蟲(chóng)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。 2.小麥根尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小麥根尖樣本共得到52.23 Gb的clean reads，每個(gè)樣本≥8.25Gb，Q30≥90.4％。每個(gè)樣品的clean reads與小麥參考基因組比對(duì)效率為64.0％至67.3％，并與唯一或多基因組位置匹配（表1）。小麥轉(zhuǎn)錄組中，共發(fā)現(xiàn)109,496個(gè)unigenes，包括9152個(gè)新基因。與Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，共注釋了6,780個(gè)新基因。數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。 表1 小麥參考基因組比對(duì)結(jié)果 3.小麥基因表達(dá)響應(yīng)分析 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組基因表達(dá)分析得到93個(gè)差異表達(dá)的unigenes（66個(gè)下調(diào)，27個(gè)上調(diào)），F(xiàn)DR<0.05和FC≥1.5（圖1）。對(duì)12個(gè)DEGs進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，其中11個(gè)DEG的表達(dá)模式與mRNA測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)果表明即使未受感染，J2線(xiàn)蟲(chóng)在小麥根部聚集也會(huì)觸發(fā)小麥的響應(yīng)。 圖1 實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組小麥DEGs的火山圖 功能注釋的結(jié)果表明，所有的DEG都能與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)上，其中一些在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫(kù)中也有注釋信息（表2）。 表2 小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的DEGs的功能注釋 GO富集分析將小麥DEGs分為28個(gè)功能組，歸為3大類(lèi)：生物學(xué)過(guò)程（60個(gè)）、細(xì)胞成分（54個(gè)）、分子功能（68個(gè)）（圖2a）。 圖2a小麥根尖unigenes 和DEG unigenes的GO分類(lèi) 在生物過(guò)程類(lèi)別中，與所有小麥根的unigenes相比，大部分DEG與代謝過(guò)程、單一生物過(guò)程、對(duì)刺激的反應(yīng)相關(guān)。細(xì)胞成分類(lèi)別中更多DEGs位于細(xì)胞外區(qū)域。 在分子功能類(lèi)別，與所有unigenes相比，DEG更多富集于營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存活性，抗氧化活性，電子載體活性，酶調(diào)節(jié)活性和催化活性等GO分類(lèi)。 KEGG通路分析來(lái)確定DEGs的生物學(xué)功能。將31個(gè)DEG分配到21個(gè)KEGG通路（圖3a）。最多數(shù)量DEGs歸類(lèi)于苯丙素生物合成通路，其次是谷胱甘肽代謝，苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝。6個(gè)DEG與苯丙烷相關(guān)通路有關(guān)，在線(xiàn)蟲(chóng)侵染的小麥根中全部下調(diào)，其中兩個(gè)基因Traes_1AS_F9013A945和Traes_2AS_EE549925C，經(jīng)qPCR驗(yàn)證有相似的表達(dá)模式。 圖3a.小麥根尖DEGs的KEGG分析 COG注釋后，小麥29個(gè)DEGs被分為6個(gè)COG功能類(lèi)別，包括能源產(chǎn)生于轉(zhuǎn)換；次級(jí)代謝物合成運(yùn)輸和代謝；僅一般功能預(yù)測(cè)；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，分子伴侶；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝（圖4a）。 圖4.DEGs的COG功能注釋 a 小麥根系 b禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng) 4.小麥DEGs生物脅迫通路圖譜 MapMan分析顯示小麥許多DEGs能比對(duì)到生物脅迫通路（圖5）：29個(gè)小麥DEGs能和生物脅迫通路相關(guān)的33個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)比對(duì)上，DEGs包含過(guò)氧化物酶，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，激素信號(hào)傳導(dǎo)（生長(zhǎng)素和茉莉酸），發(fā)病相關(guān)蛋白和次級(jí)代謝物。這些DEGs大多數(shù)在生物脅迫通路中表達(dá)下調(diào)。qPCR分析其中8個(gè)DEGs，除一個(gè)之外，其他的表達(dá)模式與測(cè)序結(jié)果一致。 圖5.小麥DEGs生物脅迫通路 在氧化還原反應(yīng)通路中，3個(gè)DEGs與過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶通路比對(duì)上，且全部下調(diào)，表明氧化還原反應(yīng)減弱。在激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中，生長(zhǎng)素和茉莉酸（JA）通路各包含2個(gè)下調(diào)的DEGs。 有7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)與6個(gè)下調(diào)的DEGs比對(duì)上，幾乎都與苯丙素類(lèi)黃酮代謝通路有關(guān)。編碼PR蛋白的防御基因有3個(gè)下調(diào)的DEG，1個(gè)下調(diào)的DEG,與細(xì)胞壁蛋白比對(duì)上，1個(gè)表達(dá)上調(diào)的DEG與細(xì)胞壁修飾通路有關(guān)。 2個(gè)下調(diào)的DEG，2個(gè)上調(diào)的DEG可比對(duì)到蛋白酶和泛素相關(guān)蛋白水解通路。 1個(gè)上調(diào)的DEG與突發(fā)性呼吸相關(guān)，隸屬乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，可比對(duì)到Traes_5DL_41E3B1B23基因，是一個(gè)上調(diào)DEG（注釋ERF071）。 5.CCN的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組CNN樣本得到30.47Gb的clean reads，每份樣本≥4.13Gb，Q30≥89.1％。共得到194,662個(gè)轉(zhuǎn)錄本和80,124個(gè)unigenes（表3）。unigenes的總長(zhǎng)、N50長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度分別為61,659,712bp，955bp、769.55bp。長(zhǎng)于1 kb的unigenes有15,197個(gè)。每個(gè)CCN樣本與組裝數(shù)據(jù)的比對(duì)效率在73.2％至79.2％之間。根據(jù)Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，共注釋了43741個(gè)unigenes。CCN樣本重復(fù)性良好。 表3 禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的組裝轉(zhuǎn)錄本及unigene一覽 6.CCN基因?qū)τ谛←湼捻憫?yīng)分析 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組CNN比較得到879個(gè)DEGs（FDR <0.01和FC≥2）。867個(gè)上調(diào)，僅12個(gè)下調(diào)。對(duì)10個(gè)DEG的表達(dá)模式進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。表明CCNs通過(guò)小麥根的刺激激活，大部分基因上調(diào)。 DEGs的功能注釋?zhuān)珿O富集分析把258個(gè)DEGs歸類(lèi)到三大類(lèi)的36個(gè)功能組中：生物過(guò)程（159個(gè)）、細(xì)胞成分（107個(gè)）、分子功能（223個(gè)）（圖2b） 圖2b 禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)unigenes 和DEG unigenes的GO分類(lèi) KEGG分析將247個(gè)DEGs歸到125個(gè)KEGG路徑，50個(gè)最顯著的通路中，核糖體通路有最多的DEG數(shù)（64個(gè)）(圖3b)，其他DEG較多的通路為細(xì)胞色素P450外源物代謝，谷胱甘肽代謝和Toll樣受體信號(hào)通路。表明CNN被小麥根部吸引時(shí)CNN的蛋白翻譯更活躍。 圖3b.禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)DEGs的KEGG分析 共386個(gè)DEGs歸類(lèi)于22個(gè)COG功能類(lèi)別。前四個(gè)DEG數(shù)目最多的COG類(lèi)別為僅一般功能預(yù)測(cè)（90個(gè)）；翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源（65個(gè)）；能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（45個(gè)）；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝（44個(gè)）（圖4b）。 7.CNN效應(yīng)基因預(yù)測(cè) 搜集PPNs的351個(gè)已知效應(yīng)子基因序列，并將CCN的DEGs與這些序列進(jìn)行比對(duì)。推測(cè)6個(gè)DEG與已知效應(yīng)基因14-3-3，幾丁質(zhì)酶，β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶，果膠酸裂解酶或組織蛋白酶具有同源性（表4）。比對(duì)上的效應(yīng)基因的描述和DEG的Nr注釋一致。對(duì)這些DEGs結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果也與基因描述一致（圖6，表4）。當(dāng)J2線(xiàn)蟲(chóng)與小麥根接觸時(shí)，編碼候選效應(yīng)蛋白的DEGs全部上調(diào)。 表4.根據(jù)禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)DEGs預(yù)測(cè)的效應(yīng)基因 圖6 禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的6個(gè)候選效應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)域 8.效應(yīng)基因的植物防御抑制驗(yàn)證 選擇兩個(gè)預(yù)測(cè)的效應(yīng)基因c68622.graph_c0和c72543.graph_c0，在本氏煙草中進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡（BT-PCD）抑制來(lái)驗(yàn)證其抑制植物防御的能力。 BAX加入后，在c68622.graph_c0，沒(méi)有明顯壞死，而c72543.graph_c0則明顯壞死（圖7）。BT-PCD抑制試驗(yàn)的兩個(gè)重復(fù)結(jié)果一致。表明前者抑制BT-PCD，而后者不抑制。c68622.graph_c0是來(lái)自H.avenae DEGs的候選基因，可能在抑制植物防御中發(fā)揮作用。 圖7.（a）c68622.graph_c0和（b）c72543.graph_c0在本氏煙草中BT-PCD的試驗(yàn) 結(jié)論： 本文擬研究在線(xiàn)蟲(chóng)與小麥根部在早期接觸階段的相互作用機(jī)制，通過(guò)mRNA測(cè)序?qū)π←満秃坦劝揖€(xiàn)蟲(chóng)在接觸早期的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)進(jìn)行了分析，鑒定了的宿主小麥根部的93個(gè)DEGs（27個(gè)上調(diào)，66個(gè)下調(diào)），寄生線(xiàn)蟲(chóng)的879個(gè)DEGs（867個(gè)上調(diào)，12個(gè)下調(diào)）。其中一些小麥DEGs（主要是下調(diào)的）與生物脅迫途徑相關(guān)，線(xiàn)蟲(chóng)DEGs中幾個(gè)推定的效應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，線(xiàn)蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶樣效應(yīng)基因能抑制本氏煙草中BAX引起的細(xì)胞程序性死亡。以上結(jié)果表明，在寄生初始接觸階段，線(xiàn)蟲(chóng)的響應(yīng)比小麥更活躍。寄生蟲(chóng)的響應(yīng)主要與基因（包括至少一個(gè)抗植物防御效應(yīng)基因）的上調(diào)相關(guān)，而宿主響應(yīng)主要與某些防御基因下調(diào)相關(guān)。     創(chuàng)新點(diǎn)： 第一個(gè)對(duì)小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)互作早期轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)性描述的研究。 參考文獻(xiàn)： Chen C, Cui L, Chen Y, et...

11月22

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Transcriptome Profiling of Watermelon Root?in Response to Short-Term Osmotic Stress 短期滲透脅迫下西瓜根組織的轉(zhuǎn)錄組研究 雜志：?PLOS ONE 影響因子：2.806 PMID:27861528 ?   研究背景： 干旱是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、限制物種分布的重要因素。干旱會(huì)影響植物某些生理生化過(guò)程（如蒸騰作用、光合作用、呼吸作用、碳水化合物和激素代謝）。植物進(jìn)化出多種應(yīng)對(duì)機(jī)制（包括逃旱性，避旱性和抗旱性），這種機(jī)制涉及精細(xì)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)及多分子通路間的相互作用。 西瓜富含必需營(yíng)養(yǎng)成分（如糖、番茄紅素、對(duì)心血管有益的氨基酸類(lèi)），是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的瓜類(lèi)作物。干旱會(huì)減少西瓜產(chǎn)量，栽培西瓜較野生西瓜抗旱性更強(qiáng)，但相關(guān)研究較少。M08是一種栽培西瓜近交品種，抗旱性強(qiáng)。為了解栽培西瓜根系對(duì)滲透脅迫響應(yīng)分子機(jī)制及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究進(jìn)行了滲透脅迫下西瓜根系的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。 材料和方法 PEG6000處理的M08植株幼苗根系，依據(jù)處理0、3、6、12、24h時(shí)表型和Cla007307 (WRKY) and Cla006761 (MYB)基因轉(zhuǎn)錄水平來(lái)確定mRNA測(cè)序時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組（T-1，T-2，T-3），與對(duì)照組(CK-1，CK-2，CK-3)一起進(jìn)行mRNA測(cè)序。 測(cè)序平臺(tái)：百邁客Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái) 分析平臺(tái)：百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）具體分析如下： 矯正后clean reads比對(duì)到西瓜參考基因組（TopHat ），基于DESeq進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEGs）分析（FC≥2，F(xiàn)DR＜0.01），隨后進(jìn)一步進(jìn)行GO分析、GO富集、KEGG通路分析。 研究結(jié)果： 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)間點(diǎn)選擇 西瓜幼苗在滲透脅迫下，6h時(shí)出現(xiàn)枯萎，12h和24h時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重枯萎（圖1A）。 Cla006761上調(diào)并在6h時(shí)達(dá)到最高，Cla017928下調(diào)在6h達(dá)到最低值（圖1B）。結(jié)合幼苗表型及Cla017928和Cla006761的動(dòng)態(tài)表達(dá)結(jié)果，選擇處理6h的樣本進(jìn)行RNA測(cè)序。 圖1A M08幼苗在滲透脅迫處理不同時(shí)間的表型特征 圖1B 滲透脅迫下P5CS、MYB基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 測(cè)序結(jié)果 6個(gè)文庫(kù)共得到32.99 Gb的clean reads，每個(gè)文庫(kù)＞40M（表1）。unique mapped reads的比例為8.513％到86.10％，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高。 表1.測(cè)序數(shù)據(jù)? qRT-PCR驗(yàn)證18個(gè)不同表達(dá)水平的基因，驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。生物學(xué)重復(fù)間相關(guān)性評(píng)估結(jié)果顯示相同處理組高度相關(guān)，CK和實(shí)驗(yàn)組相關(guān)性弱。以上結(jié)果均表明測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。 DEGs鑒定 基于DESeq進(jìn)行DEGs分析，共鑒定出滲透脅迫下5246個(gè)差異表達(dá)基因，其中2753個(gè)上調(diào)，2493個(gè)下調(diào)。DEG包含大量不同的基因，說(shuō)明西瓜根系對(duì)干旱響應(yīng)涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。 GO分類(lèi)和KEGG分析 將DEGs在與COG（2174），GO（4528），KEGG（1203），Swiss-Prot（3954）、NR（5173） 比對(duì)后，共注釋了5175個(gè)DEG?。用BLAST2GO檢索GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的DEG并用WEGO進(jìn)行GO功能分類(lèi)。將4528個(gè)DEG歸為以下三類(lèi)：生物學(xué)過(guò)程（4148），分子功能（3670）和細(xì)胞成分（4177）（圖2）。 圖2.GO分類(lèi) 富集的GO terms包含缺水響應(yīng)、高滲鹽度響應(yīng)、乙烯響應(yīng)。此外幾個(gè)高度富集的terms（植物型超敏響應(yīng)調(diào)節(jié)、損傷響應(yīng)、真菌防御響應(yīng)、防御響應(yīng)突發(fā)性呼吸）在西瓜根部不同脅迫響應(yīng)中相互作用，與其他植物中的結(jié)果一致。 一些與根生長(zhǎng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程是顯著抑制的，如細(xì)胞增殖、分生組織生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)換、細(xì)胞板形成的胞質(zhì)分裂、核糖體生物起源、核糖體、微管、翻譯、DNA復(fù)制調(diào)控、DNA復(fù)制起始等。說(shuō)明PEG誘導(dǎo)的滲透脅迫可能會(huì)抑制西瓜根系生長(zhǎng)。 植物激素在不同脅迫響應(yīng)中起重要作用，本研究中大部分涉及激素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、乙烯響應(yīng)、水楊酸生物合成過(guò)程的基因表達(dá)上調(diào)。 蛋白折疊影響蛋白質(zhì)功能，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白折疊的多種信號(hào)可激活未折疊的蛋白質(zhì)發(fā)生響應(yīng)，甚至致使細(xì)胞程序性死亡（PCD）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)是本研究中高度富集的term，表明滲透脅迫會(huì)影響蛋白折疊。在滲透脅迫時(shí)，根尖分生組織自噬PCD激活，根尖優(yōu)勢(shì)喪失，根系結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)來(lái)適應(yīng)滲透脅迫。富集到的GO terms包含細(xì)胞程序性死亡調(diào)節(jié)、根形態(tài)發(fā)生，表明滲透脅迫下PCD程序可能在根尖分生組織中激活，同時(shí)發(fā)生根系結(jié)構(gòu)重構(gòu)。 KEGG分析結(jié)果顯示共825個(gè)分配到108個(gè)不同的生化途徑。DEG最多的前5個(gè)途徑分別是核糖體、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原體相互作用、嘌呤代謝、淀粉蔗糖代謝途徑（圖3）。其中核糖體途徑變化顯著。大部分核糖體通路中的基因都是下調(diào)的，與GO分析結(jié)果一致。 圖3.KEGG分析   滲透脅迫響應(yīng)的保護(hù)基因 參與滲透調(diào)節(jié)的基因 在滲透脅迫條件下，相容性溶質(zhì)分子（如脯氨酸，甜菜堿和海藻糖）會(huì)增加，來(lái)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膨壓和水平衡。P5CS是高等植物脯氨酸合成的限速酶，鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（OAT）是脯氨酸合成鳥(niǎo)氨酸途徑中的脯氨酸合成酶。在滲透脅迫下，根中P5CS（Cla017928）和OAT（Cla019569）表達(dá)下調(diào)。而編碼脯氨酸脫氫酶的Cla016474（ProDH）上調(diào)。在滲透脅迫下TPS基因（Cla019181，Cla010101和Cla009709）和TPP基因（Cla005675，Cl008123，Cla006270和Cla014481）表達(dá)上調(diào)，參與蔗糖和肌醇半乳糖苷代謝的基因顯著上調(diào)，另外四個(gè)淀粉酶基因也是上調(diào)的。 活性氧（ROS）清除 ROS是有氧代謝過(guò)程中重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及毒副產(chǎn)物。非生物脅迫（如干旱、高鹽、洪水、寒冷和炎熱）會(huì)擾亂細(xì)胞代謝平衡，致使植物ROS生成過(guò)量，從而損傷蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，碳水化合物和DNA。突發(fā)性呼吸氧化酶同系物（Rboh）蛋白與ROS產(chǎn)生有關(guān)。植物進(jìn)化出一些高效酶（如超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶，過(guò)氧化物酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶），以及非酶抗氧化劑（ASH、GSH）來(lái)清除過(guò)量的過(guò)氧化物自由基。在本研究中，編碼Rboh的四個(gè)基因顯著上調(diào)?？箟难徇^(guò)氧化物酶，谷胱甘肽還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶，脫氫抗壞血酸還原酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以及大部分谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化物酶基因表達(dá)上調(diào)，但超氧化物歧化酶基因Cla011317表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明滲透脅迫可能誘導(dǎo)復(fù)雜的抗氧化網(wǎng)絡(luò)。此外也富集到與維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)的硫氧還蛋白和谷氧還蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。 其他滲透保護(hù)相關(guān)DEGs MATE是一組新發(fā)現(xiàn)在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本實(shí)驗(yàn)共得到18個(gè)MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的DEG。水通道蛋白是一種膜蛋白，能促進(jìn)水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并維持細(xì)胞水平衡。本研究中，共8個(gè)編碼水通道蛋白的基因顯示出差異表達(dá)。LEA蛋白是重要的細(xì)胞脫水保護(hù)蛋白，其表達(dá)量與耐脫水性相關(guān)，在滲透脅迫下有兩個(gè)LEA（Cla015386和Cla009416）上調(diào)。此外編碼分子伴侶（如熱休克蛋白（HSP），分子伴侶，DnaJ樣蛋白）的DEGs也是差異表達(dá)的。 蛋白激酶，磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEGs 滲透脅迫誘導(dǎo)植物中的鈣信號(hào)，本研究涉及Ca2 +結(jié)合蛋白的DEGs在滲透脅迫下表達(dá)上調(diào)。Map激酶級(jí)聯(lián)成員在滲透脅迫中起重要作用，本研究檢測(cè)到13個(gè)編碼MAP激酶的DEGs，幾個(gè)與SnF1相關(guān)蛋白激酶，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷酸酶有關(guān)的DEGs表達(dá)上調(diào)。在磷脂信號(hào)系統(tǒng)中，磷脂酶催化IP3和DAG等信使形成以調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。在本研究中檢測(cè)到與磷脂酶相關(guān)的DEGs（包括PLA、PLC、PLD）。許多功能基因的表達(dá)主要受特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。我們結(jié)果中也列出了轉(zhuǎn)錄因子家族的DEGs。 ? ? 7.植物激素相關(guān)DEG 植物激素介導(dǎo)植物對(duì)生物/非生物脅迫的響應(yīng)，對(duì)于植物適應(yīng)環(huán)境變化具有重要意義。本研究結(jié)果中列出了與脫落酸（ABA），生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，赤霉酸（GA），乙烯和茉莉酸（JA）等植物激素信號(hào)相關(guān)的DEGs。 編碼ABA生物合成關(guān)鍵酶NECD的Cla009779和Cla005404基因表達(dá)上調(diào)，與乙烯合成相關(guān)基因（如ERF轉(zhuǎn)錄因子、ACS、ACO等）的表達(dá)上調(diào)。吲哚-3-乙酸（IAA）是植物中的主要生長(zhǎng)素，由色氨酸（Trp）依賴(lài)/非依賴(lài)性途徑合成。YUC家族和TAA家族的色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是Trp依賴(lài)途徑中的IAA生物合成中的關(guān)鍵酶。我們結(jié)果中，兩個(gè)YUC和一個(gè)TAA表達(dá)下調(diào)，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因如LAX和PIN表達(dá)也下調(diào)。GA是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要植物激素，本研究中編碼GA生物合成關(guān)鍵酶的基因（Cla021351）表達(dá)下調(diào)，而編碼GA2-氧化酶（GA2ox）的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)，這可能使GA的內(nèi)源性水平和生物活性下降。此外，茉莉酸和細(xì)胞分裂素的生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄本也受到滲透脅迫的影響。 ? ? ?8.其他DEGs 許多與細(xì)胞分裂和根生長(zhǎng)相關(guān)的DEGs表達(dá)下調(diào)，如CYC、CDK、MAP、Ran、E2F、DOF、核糖體、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等。 泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）可去除非生物脅迫導(dǎo)致的錯(cuò)誤折疊或損傷蛋白質(zhì)。E3連接酶除在UPS中發(fā)揮重要作用外，還可調(diào)節(jié)ABA依賴(lài)的應(yīng)激信號(hào)。本研究得到了許多E2結(jié)合酶、E3-蛋白連接酶相關(guān)的DEG，說(shuō)明滲透脅迫可誘導(dǎo)UPS去除機(jī)制和E3調(diào)節(jié)機(jī)制的發(fā)生。 結(jié)論： 滲透脅迫影響西瓜的生長(zhǎng)、品質(zhì)和產(chǎn)量。增強(qiáng)西瓜對(duì)高鹽，缺水等因素引起的滲透脅迫耐性是提高生存率的有效途徑。根系是重要的吸水組織，參與滲透脅迫的初始反應(yīng)。為了更好地闡述西瓜根系組織應(yīng)對(duì)短期滲透脅迫的分子機(jī)制，將西瓜自交系M08用20％的PEG6000處理6h，未處理根組織作對(duì)照，進(jìn)行了全基因組差異基因表達(dá)分析。RNA-seq得到32.99Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集闡述了基因表達(dá)譜，鑒定出5246個(gè)差異表達(dá)的基因，GO富集和KEGG分析表明，短期滲透脅迫影響滲透調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激素應(yīng)答，細(xì)胞分裂，細(xì)胞周期和核糖體等過(guò)程，M08根組織對(duì)短期滲透脅迫響應(yīng)適應(yīng)過(guò)程與滲透調(diào)節(jié)，ROS清除、滲透脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和根系生長(zhǎng)抑制等通路有關(guān)（圖4）。 圖4.滲透脅迫下西瓜根系DEGs總覽 創(chuàng)新點(diǎn)： 這是第一個(gè)栽培西瓜品種根系滲透脅迫響應(yīng)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，為深入探討西瓜根系滲透脅迫響應(yīng)分子機(jī)制提供了新的思路。 參考文獻(xiàn)： Yang Y, Mo Y,...

11月16

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PMID:?27934932 雜志：Scientific?reports 影響因子：5.228   研究背景：目前蛋白編碼基因的功能已有了比較廣泛的研究，但對(duì)非編碼RNA（ncRNAs）功能的了解還非常少，先前ncRNAs被簡(jiǎn)單視為轉(zhuǎn)錄過(guò)程中內(nèi)含子和基因間區(qū)積累的碎片。近期的研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAs可能在很多生物、病理和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，比如它們可以調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，對(duì)細(xì)胞行為起決定性作用。但是到目前為止，我們對(duì)大部分ncRNAs的確切功能，甚至他們的表達(dá)譜還知之甚少。ENCODE計(jì)劃在人lncRNA和小鼠組織特異性元件的鑒定方面取得了很大進(jìn)展，但是很少有研究報(bào)道lncRNA在小鼠的腦、心臟和肝臟發(fā)育中的作用。此外，以往的研究表明非編碼基因比編碼基因?qū)ζ鞴俸湍挲g因素有更高的敏感性。因此，對(duì)大鼠不同發(fā)育階段中不同器官的非編碼基因的全面鑒定和注釋就顯得非常重要。 公共原始數(shù)據(jù)獲?。? 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到Y(jié)ing等人上傳的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（GSE53960）。數(shù)據(jù)集中包含來(lái)自32只大鼠的320個(gè)bodymap樣本(每只大鼠包含腎上腺、腦、心臟，腎、肝、肺、骨骼肌、脾臟、胸腺、睪丸或子宮10種不同器官)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。Ying等選取了2周、6周、21周和104周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死雌、雄兩只大鼠，進(jìn)行四次生物學(xué)重復(fù)。 技術(shù)路線(xiàn)： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.大鼠非編碼基因表達(dá)譜 為了獲得大鼠非編碼基因表達(dá)譜的概覽，作者首先提取了FPKM>0.01?的3,458個(gè)非編碼基因的表達(dá)值，其中54.8%(1,895)是假基因、33.5%(1,158)是miRNA、6.8%?(237)是lncRNA（Fig.1a）。分層聚類(lèi)分析顯示，非編碼基因的表達(dá)譜明顯按器官類(lèi)型聚類(lèi)，比編碼基因表現(xiàn)出更高的器官特異性。PVCA分析發(fā)現(xiàn)在數(shù)據(jù)集中方差貢獻(xiàn)率最多高的是器官（62.94%）（Fig.1b）。在非編碼基因表達(dá)譜的總體方差中年齡（2.82%）貢獻(xiàn)率超過(guò)了性別（0.13%）貢獻(xiàn)率（Fig.1d）。   Figure?1.?Expression?profiling?of?noncoding?genes ?2.年齡和性別相關(guān)非編碼基因的差異表達(dá)分析 ?利用Cuffdiff對(duì)非編碼基因在基因和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除腎上腺和心臟外雄性大鼠比雌性大鼠共享更多的發(fā)育階段依賴(lài)性DEnGs。所有組織中DEnGs的數(shù)目從19（雌性大鼠腦）到503（睪丸）不等（Fig.2a）。腎上腺、心、腎、肝、肌肉和胸腺表現(xiàn)出相當(dāng)數(shù)量的發(fā)育階段依賴(lài)性DEnGs，腦和肺中DEnGs的數(shù)量最少。 性別相關(guān)的DEnGs不僅取決于器官，還與年齡相關(guān)。脾臟中性別相關(guān)的DEnGs數(shù)量最多的，而肺中最少，在所有發(fā)育階段中腎上腺和胸腺顯示相當(dāng)一致的DEnGs數(shù)量。在幼鼠的大多數(shù)器官中性別特異性非編碼基因大量表達(dá)，而青春期的大鼠性別特異性的非編碼基因表達(dá)較少。幼鼠大腦中性別相關(guān)DEnGs的數(shù)量最多，這可能與發(fā)育早期大腦快速的發(fā)育速度有關(guān)（Fig.2b）。   Figure?2.?Identification?of?differentially?expressed?noncoding?genes ?3.腦和睪丸中有大量非編碼基因表達(dá) ?當(dāng)比較不同器官對(duì)時(shí)，DEnGs的數(shù)量有了很大的變化。四個(gè)發(fā)育階段中腦和肝臟與其他器官相比時(shí)獲得了相對(duì)較多的DEnGs。睪丸和胸腺中DEnGs的數(shù)量表現(xiàn)出明顯的年齡依賴(lài)性。與其他器官相比，第6和21周的大鼠睪丸中存在最大數(shù)量的DEnGs(Fig.?2c)。 4.共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了注釋大鼠非編碼基因功能，作者構(gòu)建了蛋白編碼基因和非編碼基因之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，包含3572個(gè)與年齡相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼和非編碼基因，1603性別相關(guān)基因，和16346個(gè)器官相關(guān)的基因。并通過(guò)GO分析檢測(cè)共表達(dá)分析模塊是否富集在特定的生物學(xué)過(guò)程中。 5.年齡相關(guān)的基因共表達(dá)模塊與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期和免疫系統(tǒng)發(fā)育有關(guān) 在與年齡相關(guān)的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)了包含3572個(gè)基因的14個(gè)穩(wěn)定模塊（Fig.?3c）。藍(lán)色的模塊包含1151個(gè)基因（其中有60個(gè)非編碼基因）被顯著富集到諸如細(xì)胞周期過(guò)程，細(xì)胞分裂，有絲分裂，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和RNA代謝調(diào)節(jié)GO條目中。這些條目富集結(jié)果說(shuō)明發(fā)育差異與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的代謝變化和基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。通路分析顯示細(xì)胞周期和堿基切除修復(fù)相關(guān)基因被顯著富集，提示細(xì)胞周期和自我修復(fù)功能可能受老化影響。其他模塊如棕色和綠色顯示出另一個(gè)免疫系統(tǒng)相關(guān)的富集趨勢(shì)，如免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育和淋巴器官發(fā)育。很多腦、脾臟和胸腺中的年齡相關(guān)基因與癌癥和其他年齡相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)，這提示衰老可能是通過(guò)影響免疫系統(tǒng)導(dǎo)致這些疾病的發(fā)生。其他基因主要涉及幫助免疫系統(tǒng)抵御炎癥和轉(zhuǎn)移白細(xì)胞以建立機(jī)體的防御系統(tǒng)。最后，粉紅色模塊中的七個(gè)非編碼基因與骨骼系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)。   Figure?3.?Co-expression?network?construction?on?age-related?genes. 本文還利用相同的方法構(gòu)建了器官相關(guān)和性別相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示器官相關(guān)模塊很大程度上取決于不同組織類(lèi)型的功能，性別相關(guān)模塊中包含性別發(fā)育相關(guān)基因。 6.年齡相關(guān)棕色模塊的可視化分析顯示樞紐編碼基因在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)作用 作者通過(guò)關(guān)聯(lián)3,572個(gè)年齡相關(guān)基因中的特征向量基因研究模塊和年齡之間的關(guān)系（Fig.4a），毗鄰關(guān)系反應(yīng)模塊的相關(guān)性。包含許多非編碼基因的棕色模塊與年齡有相對(duì)緊密的關(guān)系。因此選取了此模塊中189個(gè)與衰老相關(guān)的基因（包括七個(gè)非編碼基因，閾值為0.32）進(jìn)行進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)可視化分析，獲得了兩個(gè)主要的集群，其中有幾個(gè)中心基因連接著相鄰基因。雖然非編碼基因不在網(wǎng)絡(luò)的中心，但是七個(gè)大鼠的非編碼基因與免疫系統(tǒng)相關(guān)基因共同參與網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作。   Figure?4.?Network?visualization?of?age-related?brown?module. 結(jié)論：利用大鼠bodymap?RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建了大鼠4個(gè)發(fā)育階段、11個(gè)組織中的3,458個(gè)非編碼基因的表達(dá)譜。構(gòu)建了一個(gè)推斷蛋白質(zhì)非編碼基因生物學(xué)功能的編碼和非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，年齡相關(guān)模塊被富集到免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)條目。年齡相關(guān)棕色模塊的可視化分析發(fā)現(xiàn)大鼠非編碼基因與免疫系統(tǒng)相關(guān)基因共同參與網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作。 創(chuàng)新點(diǎn)：本文提供了一個(gè)鑒定和注釋大鼠非編碼基因的模型，涉及到多個(gè)器官和雌雄兩性的不同發(fā)育階段。建立了一個(gè)全面、可靠的推斷多個(gè)器官之間隨發(fā)育變化的非編碼基因表達(dá)平臺(tái)，為以后大鼠中非編碼基因表達(dá)譜研究奠定了基礎(chǔ)。...

11月16

發(fā)布于 10:25 最新文章, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

PMID:?27922056 雜志：Scientific?reports 影響因子：5.228   研究背景：隨著高通量RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)在許多物種中鑒定出了大量的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lincRNAs）。有研究表明，一些lincRNA在植入前胚胎發(fā)育（PED）過(guò)程中發(fā)揮重要作用。豬是一種理想的生殖和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究模型，然而對(duì)豬lincRNAs的研究還比較欠缺，因此需要對(duì)lincRNAs進(jìn)行全面的全基因組范圍鑒定。此外，合子基因組激活（ZGA）對(duì)成功的移植前胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此需要對(duì)ZGA的具體分子機(jī)制進(jìn)行研究。目前很少有研究報(bào)道豬PED中轉(zhuǎn)錄組的變化情況，對(duì)PED中l(wèi)incRNAs的功能研究還很有限。 公共數(shù)據(jù)獲取： 從NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到五個(gè)豬RNA-Seq數(shù)據(jù)集，Supplementary?Table?S1中列出了RNA-seq數(shù)據(jù)編號(hào)和詳細(xì)信息。 Supplementary?Table?S1?Details?of?RNA-seq?data 技術(shù)路線(xiàn)： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.基于豬RNA-seq數(shù)據(jù)集的lincRNAs鑒定 本文利用5個(gè)包含豬各種組織或細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)（Supplementary?Table?S1）對(duì)linckRNAs進(jìn)行了全面鑒定。經(jīng)reads?mapping和轉(zhuǎn)錄本組裝后從122,007個(gè)基因座鑒定出了195,531個(gè)轉(zhuǎn)錄本。排除已知mRNA并進(jìn)一步篩選后獲得了7,618個(gè)lincRNA。 2.豬lincRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 作者對(duì)預(yù)測(cè)獲得的lincRNAs和Ensemble中記錄的mRNAs進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)lincRNAs中的外顯子明顯較少(平均值：lincRNAs?2.97個(gè)、mRNAs?8.49?個(gè);?Kolomogorv-Smirnov?Test,?P-value<2.2×10?16)（Fig.?2A）。而豬lincRNAs外顯子長(zhǎng)度比蛋白編碼基因長(zhǎng)(平均值：lincRNAs?484bp、mRNAs?307bp；?Kolomogorv- Smirnov?Test，P-value<2.2×10?16)（Fig.?2B）。由于較少的外顯子數(shù)量，整體lincRNA長(zhǎng)度小于蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度(平均值：lincRNAs?1338?bp、mRNAs?2842?bp；Kolomogorv-Smirnov?Test，P-value<2.2×10?16)?(Fig.?2C)。 Figure?2.?Features?of?pig?lincRNAs. ? ? ? ? 3.豬lincRNAs的低表達(dá)量和組織特異性 ? ? ? ? 對(duì)不同組織和細(xì)胞系中l(wèi)incRNAs的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示lincRNAs與蛋白編碼基因相比表達(dá)量較低。為了定量評(píng)估每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特異性，作者應(yīng)用依賴(lài)于Jensen-Shannon（JS）距離算法的基于熵度量法計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特異性。結(jié)果顯示，lincRNAs比蛋白編碼基因表現(xiàn)出更高的JS平均值（Fig.?3B），這說(shuō)明lincRNAs比蛋白編碼基因有更高的組織特異性。 Figure?3.?Characteristics?of?pig?lincRNAs?expression. ? ? ? ? 4.lincRNAs與鄰近蛋白質(zhì)編碼基因之間潛在的順式作用關(guān)系 ? ? ? ? 研究表明，lincRNAs可能通過(guò)正、負(fù)兩種方式調(diào)節(jié)鄰近蛋白編碼基因表達(dá)。通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)豬lincRNAs的鄰近蛋白編碼基因被富集到“轉(zhuǎn)錄調(diào)控”功能。對(duì)lincRNA與鄰近蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）距離的分析發(fā)現(xiàn)了462個(gè)TSSs距離在4kb以?xún)?nèi)的lincRNA:mRNA對(duì)。值得注意的是lincRNA:mRNA對(duì)中32%的lincRNAs始于400nt內(nèi)，而mRNA:mRNA對(duì)只有12%（Fig.?3D）。這些結(jié)果說(shuō)明豬的lincRNAs可以順式調(diào)節(jié)他們鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)。 5.植入前胚胎發(fā)育相關(guān)lincRNAs的功能分析 過(guò)濾除去每個(gè)胚胎發(fā)育階段的低方差lincRNAs和mRNAs后,進(jìn)行了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）探索豬PED過(guò)程中l(wèi)incRNA的作用。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析鑒定出了23個(gè)共表達(dá)模塊（Fig.?4A）。其中5個(gè)模塊顯示發(fā)育階段特異性（Fig.?4B），它們可能代表每一個(gè)過(guò)渡階段的核心基因網(wǎng)絡(luò)。為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)lincRNAs在豬PED過(guò)程中發(fā)揮的功能，作者對(duì)每個(gè)階段特異性模塊進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)ZGA的4細(xì)胞到8細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段的模塊被富集到轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀調(diào)控和細(xì)胞周期條目中（Fig.?4C）。 Figure?4.?Function?prediction?of?PED?associated?lincRNAs. ? ? ? ? 6.豬植入前胚胎發(fā)育樞紐?linckRNA的鑒定 ? ? ? ? 為了鑒定豬PED中的樞紐linckRNA，作者利用WGCNA測(cè)量了模塊內(nèi)的基因間連接，并提取了每個(gè)階段特異性模塊中的前100個(gè)樞紐基因。然后在4細(xì)胞階段特異性模塊中的樞紐基因集中選取10個(gè)lincRNAs進(jìn)行了qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)這些lincRNAs在生殖組織中作為一個(gè)整體表達(dá)（Fig.?5A）。研究還發(fā)現(xiàn)在卵巢中高表達(dá)的兩個(gè)lincRNAs：tcons_00166370和tcons_00020255?在4細(xì)胞階段顯示出明顯的激活趨勢(shì)，而8細(xì)胞階段迅速下調(diào)（Fig.?5B）。盡管這些參與豬PED過(guò)程的lincRNAs的作用機(jī)制還不清楚，樞紐lincRNAs的鑒定為進(jìn)一步的功能研究提供了寶貴的資源。 Figure?5.?The?expression?of?two?hub?lincRNAs?from?4-cell?stage-specific?module?in?different?tissues?and?PED. 結(jié)論：進(jìn)行了完整的豬lincRNAs分析，提供了首個(gè)豬植入前胚胎發(fā)育相關(guān)lincRNAs圖譜。WGCNA分析顯示PED相關(guān)lincRNAs與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控過(guò)程有關(guān)。對(duì)樞紐lincRNAs的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與PED密切相關(guān)的lincRNA：TCONS_00166370?和TCONS_00020255。...

11月14

發(fā)布于 17:44 最新文章, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Populus simonii × Populus nigra?WRKY70 is involved in salt stress?and leaf blight disease responses 小黑楊WRKY70基因在鹽脅迫和葉枯病響應(yīng)中的作用 雜志：Tree Physiology 影響因子：3.653 PMID:?28369503 研究背景： WRKY超家族是重要的植物轉(zhuǎn)錄因子(TF)家族成員，其DNA結(jié)合域有保守的N端WRKYGQK七肽。WRKY蛋白可特異性識(shí)別結(jié)合靶基因啟動(dòng)子的順式元件(CE)，w-box(TTGACC/T)。過(guò)去20多年的研究表明WRKY是多種生物學(xué)過(guò)程（如種子休眠/萌發(fā)、衰老、發(fā)育和生物/非生物脅迫響應(yīng)）信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。WRKY蛋白通常會(huì)激活或抑制植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，一些WRKYs甚至同時(shí)具有激活和抑制作用。一種WRKY 轉(zhuǎn)錄子也可調(diào)節(jié)幾個(gè)不同生物學(xué)過(guò)程。 植物常受到各種生物/非生物脅迫。鹽和病原體脅迫是常見(jiàn)的環(huán)境刺激，鹽脅迫會(huì)影響離子滲透壓平衡，排毒及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程。菌類(lèi)脅迫會(huì)使植株產(chǎn)生葉斑，腐爛和枯萎。植物進(jìn)化出精細(xì)響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)適應(yīng)這些脅迫，許多TFs是生物/非生物脅迫信號(hào)響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)控點(diǎn)。WRKY蛋白作為一種重要的脅迫響應(yīng)TFs，參與了廣泛的生物和非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。 小黑楊在中國(guó)北方分布廣，這種雜交白楊生長(zhǎng)迅速，能很好地適應(yīng)高鹽，寒冷，干旱和貧瘠的環(huán)境，因此是一種研究木本植物脅迫響應(yīng)機(jī)制的理想材料。我們既往轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，在小黑楊受到鏈格孢侵染或在鹽堿、干旱和重金屬脅迫下PsnWRKY70基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。我們推測(cè)PsnWRKY70基因可能在小黑楊生物/非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。既往在WRKY蛋白的生物功能方面的研究進(jìn)展較多，但關(guān)于調(diào)控機(jī)制的闡述有限。因此進(jìn)一步研究PsnWRKY70轉(zhuǎn)錄子在小黑楊脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用具有重要意義。 材料和方法 材料：小黑楊 培養(yǎng)條件： 鹽脅迫實(shí)驗(yàn)：在25-32℃溫室，自然光照條件下，140mM的NaCl溶液處理 葉枯病脅迫實(shí)驗(yàn)：條件為:白天/晚上氣溫，25℃/20℃;濕度,50-60%;光周期,16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗;光合光子通量，150 μmol m-2?s-1。 處理組： .鹽脅迫實(shí)驗(yàn)組：2個(gè)月月齡的NT，OEX和REX植株每隔三天用140mM的NaCl溶液處理。 葉枯病脅迫實(shí)驗(yàn)組：2個(gè)月月齡的NT，OEX和REX植株噴灑鏈格孢菌孢子懸液。在處理前(0 h)和處理后36 h收集第三至第五功能葉片用于提取RNA。分別在0天，處理后3、6、9、12天收集第六到第八個(gè)功能葉用于MDA含量測(cè)定。 對(duì)照組：用水處理，所有樣本三個(gè)重復(fù)。 轉(zhuǎn)錄組分析:在葉枯病抗性分析培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的NT、OEX1和REX1的植株，長(zhǎng)到30厘米后用140 mM的NaCl溶液處理。收集鹽脅迫36小時(shí)后的第五個(gè)功能葉(兩個(gè)重復(fù)) 測(cè)序平臺(tái)：百邁客高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq 4000 分析平臺(tái)：百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）主流程和小工具 方法： 本文擬研究小黑楊的生物/非生物脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)： 啟動(dòng)子克隆及序列分析：為全面了解PsnWRKY70基因的生物學(xué)功能，對(duì)PsnWRKY70啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，并對(duì)啟動(dòng)子CEs進(jìn)行了生信分析，預(yù)測(cè)了PsnWRKY70的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。 2.酵母單雜交篩選和驗(yàn)證：進(jìn)行了酵母單雜交篩選來(lái)研究PsnWRKY70基因的上游調(diào)控子，并對(duì)PsnWRKY70，PsnMYB，PsnNAM和PsnGT1蛋白質(zhì)與PsnWRKY70基因啟動(dòng)子互作關(guān)系進(jìn)行分析。 3.PsnWRKY70基因序列和表達(dá)分析：對(duì)PsnWRKY70基因開(kāi)放閱讀框和保守域進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定了PsnWRKY70 TF的物理化學(xué)參數(shù)，預(yù)測(cè)了亞細(xì)胞定位。并與TAIR和RGAP數(shù)據(jù)庫(kù)部分?jǐn)M南芥和粳稻的Group III WRKY TFs序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(ClustalW）構(gòu)建得到不同物種32種WRKY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（MEGAver.6.0）。 4.基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證：克隆了PsnWRKY70的開(kāi)放閱讀框架(ORF)并融合到綠色熒光蛋白(GFP)中，OEX和REX載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片轉(zhuǎn)換法將重組子轉(zhuǎn)移到小黑楊中。并進(jìn)行了PCR、Northern blot、表達(dá)量水平的驗(yàn)證。 5.脅迫分析：根據(jù)表型、損傷指數(shù)、丙二醛(MDA)含量和基因表達(dá)模式對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(NT)組的鹽脅迫耐力和葉枯萎病抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。 6.轉(zhuǎn)錄組分析：為進(jìn)一步確定了PsnWRKY70 轉(zhuǎn)錄子的鹽脅迫反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，選擇鹽脅迫處理的轉(zhuǎn)基因和NT葉片作為樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。 研究結(jié)果： 1.啟動(dòng)子分析和酵母單雜交實(shí)驗(yàn) 克隆了2471bp的PsnWRKY70基因的啟動(dòng)子序列，分析顯示提示許多脅迫響應(yīng)CEs存在于PsnWRKY70的啟動(dòng)子區(qū)域，這些CEs中,W-box(TGAC)和GT1元素(GAAAAA)是高度富集的，酵母單雜交篩選結(jié)果顯示，有五個(gè)基因(PsnBTB/POZ、PsnCCD1、PsnZFP、PsnWRKY70、PsnFP)可與W-box及其相鄰序列結(jié)合，同時(shí)七個(gè)基因產(chǎn)物(PsnNAM、PsnDDS1、PsnMYB、PsnLHTP、PsnGT1、PsnETIF6-2、PsnAPD）可與GT1元件和其鄰近序列結(jié)合。 為進(jìn)一步證實(shí)PsnWRKY70 /PsnMYB / PsnNAM /PsnGT1蛋白與相應(yīng)CEs的互作關(guān)系，將報(bào)道載體(pCAM-Wr/Wm/Gr/Gm) 和效應(yīng)載體(pROKII-W70/MYB/GT1/NAM)共轉(zhuǎn)移到煙草葉片中，GUS/LUC相對(duì)活性實(shí)驗(yàn)表明：在鹽脅迫條件下PsnWRKY70可特異性結(jié)合W-box,而PsnMYB、PsnGT1、PsnNAM可特異性結(jié)合GT1元素。   2.PsnWRKY70基因序列分析和表達(dá)分析 PsnWRKY70的ORF長(zhǎng)度為966bp,編碼321個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。單WRKY域和Cx7Cx23HxC-type鋅指狀模體表明PsnWRKY70 TF是Group?III成員。PsnWRKY70蛋白化學(xué)式可能的是C1553H2405N445O513S16,理論pI 為5.72，分子量為36.03 kDa。亞細(xì)胞定位顯示PsnWRKY70存在于細(xì)胞核的可能性最大。多序列比對(duì)結(jié)果顯示PsnWRKY70與擬南芥和粳稻的Group?III WRKY TFs一致(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明PsnWRKY70和胡楊WRKY70具有高同源性(XP_011001689.1)(圖2)。qRT-PCR 檢測(cè)PsnWRKY70在小黑楊不同組織種表達(dá)水平不同，在葉中高表達(dá),根和莖中低表達(dá)，因此選擇葉片作為材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 圖1多重序列比對(duì)（紅盒框內(nèi)序列為保守WRKY域,藍(lán)框內(nèi)氨基酸殘基為鋅指模體。） 圖2系統(tǒng)發(fā)育分析：來(lái)自不同物種的WRKY蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),紅色標(biāo)識(shí)的蛋白質(zhì)為PsnWRKY70 TF 3.PsnWRKY70 轉(zhuǎn)基因植株的培育和驗(yàn)證 為進(jìn)一步研究PsnWRKY70 基因在不同脅迫中的生物學(xué)功能，通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，構(gòu)建小黑楊PsnWRKY70基因過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，并在轉(zhuǎn)基因和NT植株中進(jìn)行了脅迫響應(yīng)分析。得到了8個(gè)OEX植株和10個(gè)REX植株并通過(guò)gDNA?PCR、Northern blot、基因表達(dá)水平結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。 4.轉(zhuǎn)基因植株和NT植株的鹽脅迫和葉枯病脅迫響應(yīng) 數(shù)據(jù)顯示在正常生長(zhǎng)條件下REX植株(REX1-REX3)一般都比OEX(OEX1-OEX3)和NT植株高(表1和2)。 在鹽脅迫下,REX植株的RHGRs明顯大于NT和OEX。此外,在所有鹽脅迫處理的植株中,REX1有最大的RHGR(0.296±0.008),而OEX2是最小的RHGR(0.199±0.011)(表1)。在病菌脅迫下，REX往往比NT和OEX生長(zhǎng)慢。OEX3的RHGR最大(0.264±0.019)REX1的RHGR最小(0.154±0.012)。(表2)。 表1鹽脅迫下的OEX、REX和NT植株的HG 表2葉枯病脅迫下OEX、REX和NT植株的HG 葉鹽損傷指數(shù)表明,OEX比NT和REX損傷更大。而葉病指數(shù)表明,REX比NT和OEX葉疾病癥狀更嚴(yán)重。此外,REX2葉鹽害指數(shù)最小(52.06%±1.34%),OEX2葉枯病指數(shù)最小(27.30%±1.50%)(圖3a-d）。 圖3...

10月31

發(fā)布于 15:46 最新文章, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Genome-Wide Analysis Reveals Extensive Changes?in LncRNAs during Skeletal Muscle Development?in Hu Sheep 湖羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中全基因組范圍LncRNAs的顯著變化 ? 雜志：?genes? 影響因子：3.600 PMID:?28763026 ? ?   研究背景： 羊肉具有蛋白含量高、脂肪和膽固醇含量低等優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)羊的肌肉生長(zhǎng)可提高羊肉產(chǎn)量。過(guò)去關(guān)于羊骨骼肌生長(zhǎng)的研究主要集中在蛋白質(zhì)編碼基因，然而基因組絕大部分是非編碼序列。長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNAs）是一種重要的非編碼RNA，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)某些功能型的lncRNAs是新的肌肉調(diào)節(jié)元件，發(fā)揮重要作用。關(guān)于羊肌肉相關(guān)lncRNA的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究較少，尤其關(guān)于湖羊的研究更少， lncRNA在羊骨骼肌生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)類(lèi)型和潛在作用大部分都是未知的，因此了解羊不同生長(zhǎng)時(shí)期肌肉轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義。 本文擬研究湖羊三個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)階段（110天胎兒期，5天幼年期，2歲成年期）肌肉lncRNA的表達(dá)模式和潛在作用，篩選差異表達(dá)lncRNA的和DEGs（差異表達(dá)基因）的靶基因。同時(shí)通過(guò)lncRNA-gene網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)湖羊肌肉生長(zhǎng)的lncRNA潛在調(diào)控因子，獲得湖羊肌纖維生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄水平的候選調(diào)節(jié)因子。 材料和方法 材料：相同的自然光環(huán)境下飼養(yǎng)的胎兒期、幼年期、成年期湖羊，每個(gè)時(shí)期選取3個(gè)隨機(jī)樣本，取既定部位（12和13胸椎之間）的LD肌肉樣本，采樣后即刻液氮冷凍提取RNA。 測(cè)序平臺(tái)：Illumina platform 分析平臺(tái)：百邁客云平臺(tái)（BMKCloud），分析內(nèi)容如下： 在百邁客云平臺(tái)上，對(duì)胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq測(cè)序后轉(zhuǎn)錄組拼接。進(jìn)行注釋后，先排除＜200個(gè)核苷酸或單外顯子的轉(zhuǎn)錄子,再用CPC,CNCI,PFAM,CPAT等工具從未知轉(zhuǎn)錄組中篩選候選lncRNA。四種方法FPKM＞0.1的轉(zhuǎn)錄子交集定義為lncRNA轉(zhuǎn)錄子。 應(yīng)用DEGseq packages (1.10.1)?來(lái)分析組間的表達(dá)差異，F(xiàn)DR值＜5%，log2(倍數(shù)變化)的絕對(duì)值被定義為差異化表達(dá)。 預(yù)測(cè)差異表達(dá)的lncRNA的順式靶基因和反式靶基因。 為分析lncRNA的主要功能，通過(guò)NCBI的Nr、GO、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行靶基因和DEGs注釋?zhuān)琄S≤0.05，信號(hào)通路矯正p值≤0.05的GO term被定義為顯著富集的。 為進(jìn)一步研究lncRNA和他們的靶基因的相互作用，建立LncRNA-Gene共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)果： 1.測(cè)序拼接和轉(zhuǎn)錄組分析 胎兒期、幼年期、成年期3組RNA-seq序列質(zhì)控后，經(jīng)過(guò)去接頭、多聚尾、低質(zhì)量序列后，每組平均獲得了65578070，65591958,71241551的拼接序列，9個(gè)文庫(kù)平均GC含量為54.39%，每個(gè)樣本Q30值≥91.71%，?92%以上與O. aries參考基因組特異性匹配，分析顯示胎兒期有45.1%的序列與外顯子區(qū)域匹配，后期階段匹配度更高（幼年期53.8%、成年期53.7%），在幼年、成年期組的內(nèi)含子和基因間序列比例低于胎兒期。（表1） 表1.矯正后序列與不同階段湖羊參考基因組比對(duì) 2.lncRNA篩選和特征性描述 為研究湖羊肌肉lncRNA的基本特征，篩選lncRNA并與mRNA比對(duì)。CPC、CNCI、PFKM、CPAT交集部分有6924個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄子，包括已知的保守lncRNA，肌肉分化相關(guān)的lncMD（圖1A） 圖1 A 韋恩圖 ?圖1B. lncRNA和mRNA在每個(gè)染色體上的分布比例。紅色和黑色線(xiàn)條分布代表lncRNA和mRNA，藍(lán)色線(xiàn)條代表相應(yīng)染色體在基因組中的大小比例 lncRNA轉(zhuǎn)錄子分為4606個(gè)lincRNA（66.5%），1131個(gè)內(nèi)含子lncRNA（16.3%）,1187個(gè)反義lncRNA（17.1%）。與mRNA類(lèi)似，lncRNA轉(zhuǎn)錄子在26對(duì)染色體和X染色體中分布廣泛，但線(xiàn)粒體中不存在。而且lncRNA在幾個(gè)染色體中的比例與染色體大小比例一致，尤其是18號(hào)染色體，表明在此研究中相應(yīng)lncRNA可能體現(xiàn)重要功能（圖1B） 比較lncRNA和mRNA的外顯子特征，結(jié)果顯示大部分lncRNA每個(gè)轉(zhuǎn)錄子包含2-5個(gè)外顯子（均值3.3），比mRNA少（均值7.9，圖1C） 圖1C 湖羊lncRNA每個(gè)轉(zhuǎn)錄子外顯子數(shù) ?????圖1D 湖羊lncRNA外顯子大小分布 另外大部分lncRNA包含2個(gè)外顯子，而包含2個(gè)外顯子的mRNA僅占比3.9%，明顯低于lncRNA。lncRNA中外顯子平均長(zhǎng)度相對(duì)長(zhǎng)于mRNA，大部分小于200bp（圖1D）。與蛋白編碼基因一致，在肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中同一階段lncRNA表達(dá)趨勢(shì)相似，且平均表達(dá)水平比與蛋白編碼基因低（圖2A,B） 每組重復(fù)間的相關(guān)性分析顯示相關(guān)性高（圖3A-C），而且在6924個(gè)表達(dá)的lncRNA轉(zhuǎn)錄子中，于某一生長(zhǎng)階段特異性表達(dá)的占比33.03%，這個(gè)比例在蛋白編碼基因中較低（4%），提示lncRNA的特殊意義和動(dòng)態(tài)特性。胎兒期特異性lncRNA為1042個(gè)，遠(yuǎn)高于幼年期（626）和成年期（619），表明lncRNA在早期發(fā)展階段的重要意義。 圖2A胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉lncRNA的FPKM分布 圖2B胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉蛋白編碼基因的FPKM分布 圖3 每組重復(fù)間的相關(guān)系數(shù)分析（A胎兒期組，B幼年期組，C成年期組） 3.差異表達(dá)分析及靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè) 3個(gè)時(shí)期兩兩比較分析顯示在胎兒期vs幼年期、幼年期vs成年期、胎兒期vs成年期（對(duì)照組vs實(shí)驗(yàn)組），分別有27、14、92個(gè)lncRNA，239 270 1437個(gè)基因是特異性表達(dá)的。(|log2FC| > 1, FDR < 0.05).值得一提的是，幼年期vs成年期組差異表達(dá)的lncRNA量最低，在胎兒期vs幼年期組和幼年期vs成年期組，DEGs的數(shù)量幾乎一樣多，表明產(chǎn)前和產(chǎn)后盡管在時(shí)間只相差1一個(gè)月，但是轉(zhuǎn)錄水平的差異較大（圖4A-D）。 圖4 對(duì)比組差異表達(dá)lncRNA和基因的數(shù)量（A 不同對(duì)比組差異表達(dá)lncRNA數(shù)量的韋恩圖 B 不同對(duì)比組DEGs數(shù)量的韋恩圖C不同對(duì)比組差異表達(dá)lncRNA總數(shù) D不同對(duì)比組DEGs總數(shù)） 差異表達(dá)的lncRNA中，在胎兒期vs幼年期有36個(gè)上調(diào)lncRNA，42個(gè)下調(diào)lncRNA，幼年期vs成年期有13個(gè)上調(diào)lncRNA，28個(gè)下調(diào)lncRNA，胎兒期vs成年期有68個(gè)上調(diào)lncRNA，78個(gè)下調(diào)lncRNA。DEGs中，胎兒期vs幼年期組有1028個(gè)上調(diào)基因和487個(gè)下調(diào)基因、幼年期vs成年期組有659個(gè)上調(diào)基因和900個(gè)下調(diào)基因、胎兒期vs成年期有1862個(gè)上調(diào)基因和1749個(gè)下調(diào)基因。差異表達(dá)的lncRNA和DEGs的分層集群顯示幼年期和成年期的表達(dá)模式相似而與胎兒期有所差異（圖4E,F）。 圖4 E 差異表達(dá)的lncRNA的分層集群 ?F DEGs的分層集群 為進(jìn)一步評(píng)估RNA測(cè)序的結(jié)果，選擇MYOG(從胎兒期富集的與晚期肌肉細(xì)胞分化相關(guān)的基因)，MYH7(肌肉結(jié)構(gòu)基因)，5種差異表達(dá)的lncRNA，4種DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析。表達(dá)量與RNA-Seq結(jié)果一致。結(jié)果表明表達(dá)與測(cè)序結(jié)果有較好相關(guān)性，表明測(cè)序結(jié)果可行度高。 lncRNA可以通過(guò)與靶基因順式和反式作用發(fā)揮功能，通過(guò)兩兩對(duì)比分析，預(yù)測(cè)相鄰上下游100kb的和或差異表達(dá)lncRNA的互補(bǔ)蛋白編碼基因。得到共201個(gè)靶基因。 圖5 qRT-PCR和RNA-Seq分別驗(yàn)證不同時(shí)期湖羊肌肉差異表達(dá)lncRNA和基因的表達(dá)水平 4.差異表達(dá)的lncRNA和mRNA靶基因的生信分析 為進(jìn)一步研究差異表達(dá)的lncRNA,通過(guò)與NR / GO/...

10月31

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通過(guò)全基因組Bisulfite測(cè)序技術(shù)研究羊卵巢DNA甲基化與生產(chǎn)力之間的關(guān)系 雜志：BMC Genomics 影響因子：3.729 PMID：28969601 ? 背景 DNA甲基化是一種表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制，在生物學(xué)調(diào)控過(guò)程中起著重要的作用，比如基因表達(dá)、基因印記、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)生以及決定生物的表型和可塑性。甲基化發(fā)生在胞嘧啶殘基的CpG核苷酸上。目前，哺乳動(dòng)物中，通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行全基因組甲基化探索重要的生物學(xué)功能的技術(shù)被廣泛應(yīng)用。對(duì)農(nóng)戶(hù)而言，羊的生產(chǎn)效率以及產(chǎn)仔次數(shù)是重要的經(jīng)濟(jì)回報(bào)指標(biāo)。通常情況下，生殖性狀的遺傳性在中等及以下，并且對(duì)表型選擇的效果并不顯著。因此，研究生殖能力相關(guān)的基因信息可以提高選擇效率。繁殖能力由卵巢濾泡調(diào)控，該過(guò)程被精確的增殖和分化事件調(diào)控。近期的研究主要集中在DNA甲基化如何調(diào)控卵巢的形成和生殖系統(tǒng)發(fā)育上。一些證據(jù)表明，卵巢的發(fā)育受DNA甲基化的調(diào)控。通過(guò)對(duì)豬的卵巢甲基化分析發(fā)現(xiàn)，在豬的性別和卵巢發(fā)育成熟過(guò)程中存在甲基化的改變。在山羊下丘腦甲基化研究中也存在類(lèi)似的結(jié)果。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，但是想弄清楚DNA甲基化模式與生產(chǎn)力之間的關(guān)系仍然有局限。湖羊被公認(rèn)為生殖系統(tǒng)成熟早且生產(chǎn)能力強(qiáng)，然而，最近幾年的研究中，更多的注意力集中在肉質(zhì)上，選擇過(guò)程中關(guān)注生殖特征的研究相對(duì)較少。繁殖是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，例如產(chǎn)仔數(shù)量這一特征受許多微效基因和一些主要基因的影響。所以了解DNA甲基化在基因功能中的作用非常必要。該研究中選用WGBS的技術(shù)對(duì)湖羊甲基化進(jìn)行研究，系統(tǒng)的分析了DNA甲基化模式與產(chǎn)仔數(shù)量的潛在關(guān)系。另外，此項(xiàng)研究也可以增加對(duì)湖羊甲基化的認(rèn)知和了解。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)材料：共選取6只湖羊（Hu sheep ），年齡3歲，非妊娠母羊，分為兩組： HP組（高生產(chǎn)力組）：3只湖羊，有3次產(chǎn)仔記錄（n=3，litter size=3） LP組（低生產(chǎn)力組）：3只湖羊，有1次產(chǎn)仔記錄（n=3，litter size=1） 分別將處于發(fā)情期的母羊在12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行屠殺，收集身體同側(cè)的卵巢，迅速用液氮冷凍， -80?°C儲(chǔ)存，分別提取DNA和RNA，DNA進(jìn)行bisulfite處理。 測(cè)序平臺(tái)：北京百邁客生物科技有限公司 IlluminaHiSeq 2500平臺(tái)，兩組分別選取3個(gè)樣本進(jìn)行WGBS測(cè)序，兩組總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 分析平臺(tái)：所有數(shù)據(jù)在百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）進(jìn)行分析，分析內(nèi)容如下： 1.參考基因組比對(duì) 測(cè)序片段在進(jìn)行甲基化分析之前需要與參考基因組比對(duì)，通過(guò)bisulfite處理和PCR擴(kuò)增將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶（T）。應(yīng)用Bismark 軟件將bisulfite處理的片段與參考基因組（Oar_v3.1）比對(duì)，其他數(shù)值均選用百邁客云平臺(tái)的默認(rèn)參數(shù)。用該軟件進(jìn)行測(cè)序深度和覆蓋度的統(tǒng)計(jì)，以及bisulfite轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)，甲基化類(lèi)型確定。Bismark 軟件不能辨別單個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，參數(shù)設(shè)置為coverage ≥ 4×，F(xiàn)DR< 0.05。 2.評(píng)估甲基化水平以及鑒定DMRs 使用MOABS軟件對(duì)覆蓋度大于10X的胞嘧啶位點(diǎn)進(jìn)行DMRs（差異甲基化區(qū)域）分析，運(yùn)用如下公式： 3.DMGs（差異甲基化基因）生物信息分析 將DMGs與GO,COG,KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析這些基因的功能，進(jìn)行GO富集分析，以及應(yīng)用KOBAS軟件對(duì)KEGG通路中顯著富集的差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測(cè)。并且利用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)選取的DMGs進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析。 結(jié)果 1.DNMTs表達(dá)水平 首先用qRT-PCR的方法分別對(duì)HP組和LP組卵巢中DNMTs（DNMT1, DNMT3A和?DNMT3B）表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)HP組中DNMT1和?DNMT3A的表達(dá)水平顯著低于LP組(P < 0.05)。 圖1.?HP組和LP組卵巢DNMTs的表達(dá)水平分析 2.DNA甲基化比對(duì)以及甲基化模式分析 HP組和LP組每個(gè)樣平均產(chǎn)生的clean數(shù)據(jù)分別是63.59G和66.72G。比對(duì)率在71.36%-74.68%之間。平均每個(gè)組中胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化率在3.5%左右。 表1.全基因甲基化測(cè)序結(jié)果 該研究中發(fā)現(xiàn)了3種甲基化的模式：CG，CHG(H 表示?A，C或?T), 和?CHH，這些類(lèi)型在HP和LP兩個(gè)組的比例是非常相似的。HP組中：89.78% CG，?2.46% CHG，?7.76% CHH；LP組中：88.60% CG，2.66% CHG，8.74% CHH。 圖2.甲基化模式分析 3.甲基化序列偏好性分析 通過(guò)小提琴作圖分析，圖中不同的點(diǎn)代表不同的甲基化水平，且通過(guò)橫截面積可以看出CG甲基化類(lèi)型的數(shù)量較多，而CHG和CHH甲基化類(lèi)型的數(shù)量較低。通過(guò)各樣本染色體甲基化圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，染色體中大多數(shù)超甲基化胞嘧啶是CG類(lèi)型的，并且不同組中染色體上的胞嘧啶甲基化位點(diǎn)有差異，如18號(hào)染色體。另外，研究者還分析了sequence context和甲基化偏好性之間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)了所有可能的9個(gè)堿基序列甲基化百分比，mC位點(diǎn)處于超甲基化狀態(tài)中，CAG是CHG甲基化位點(diǎn)中絕大多數(shù)共同序列motif，并且兩個(gè)組中CHH contexts的頻率不一樣。 圖3.各樣本甲基化分布小提琴圖 4.不同功能區(qū)域DNA甲基化水平 研究者將所有的mC分為啟動(dòng)子、5 ’UTR、外顯子、內(nèi)含子、3 ’UTR這幾個(gè)基因功能區(qū)域，通過(guò)這些功能區(qū)域?qū)谆竭M(jìn)行評(píng)估。兩組中，各區(qū)域表現(xiàn)出相似的甲基化水平，并且CG類(lèi)型的甲基化水平高于CHG和CHH類(lèi)型。mC的大部分位點(diǎn)發(fā)生在內(nèi)含子、外顯子（第一個(gè)外顯子除外）及下游區(qū)域。此外，在第一個(gè)外顯子中CG甲基化水平低于除上游區(qū)域以外的其他部分，上游區(qū)域的甲基化水平表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，TSS（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）附近的CG位點(diǎn)甲基化水平低于首個(gè)外顯子區(qū)域的甲基化水平。另外，在外顯子和內(nèi)含子中檢測(cè)到高度甲基化，并且這種甲基化水平從啟動(dòng)子區(qū)到TSS區(qū)逐漸下降，從TSS區(qū)到內(nèi)含子去逐漸增加。CHH類(lèi)型是低甲基化一類(lèi)并且在各功能區(qū)域較穩(wěn)定，CHG類(lèi)型幾乎未甲基化。 圖4.CGI不同功能趨勢(shì)圖 5.CGI區(qū)域甲基化注釋 CGI（CG島）區(qū)域功能注釋發(fā)現(xiàn)，約68%超甲基化CGI分布在基因間區(qū)，1.5%的超甲基化CGI分布在UTR區(qū)，在兩個(gè)組中沒(méi)有顯著差異（P > 0.05）。 圖5. 不同功能部分CGI甲基化分布比例 6.HP組和LP組DMRs分析 檢測(cè)兩組DMRs以及根據(jù)不同的甲基化類(lèi)型進(jìn)行基因功能注釋。共鑒定了70,899個(gè) CG 類(lèi)型DMRs，?16 個(gè)CHG類(lèi)型 DMRs以及356個(gè) CHH 類(lèi)型DMRs。大多數(shù)在基因間區(qū)，5 ’ UTR 和?3 ’ UTR分別只有33和162個(gè)DMRs?；谒械募谆?lèi)型，除基因間區(qū)外內(nèi)含子中DMRs的比例最高。研究人員還對(duì)兩組DMRs進(jìn)行了熱圖聚類(lèi)分析。 圖6.不同基因功能區(qū)不同甲基化模式中DMRs比例 7.測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證 為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，從測(cè)序結(jié)果中隨機(jī)選取10個(gè)DMGs進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示HP組中GPNMB，ELK4，?BACH1，?CDIPT表達(dá)水平顯著低于LP組，而SCYL1表達(dá)水平顯著高于LP組（P < 0.05），兩組中?ABCG2，mTOR，STK3，?ACVR1...

10月26

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題目：mRNA-miRNA整合分析揭示BR、auxin信號(hào)通路參與調(diào)控油菜分蘗（分枝）角度 發(fā)表雜志：Int J Mol Sci ?影響因子：3.226 研究背景 油菜是全球范圍內(nèi)非常重要的一種油料作物，隨著人口的增加與可用耕地面積的減少，最大限度提高包括油菜在內(nèi)的各類(lèi)作物的產(chǎn)量成為了育種學(xué)家考慮的一個(gè)重要問(wèn)題。增大單位土地上的種植密度是一種增加作物產(chǎn)量的策略，每棵植物生長(zhǎng)所需的地上面積主要由側(cè)枝的數(shù)量、長(zhǎng)度與著枝角度決定，這些因素中，對(duì)側(cè)枝及葉子著枝角度的研究對(duì)于植物的高密度種植策略的應(yīng)用具有重要的意義。 在以往的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，水稻中的LAZY1,、TILLER ANGLE CONTROL1、PROSTRATE GROWTH1、 LOOSE PLANT ARCHITECTURE1基因，玉米中的ZmTAC1、ZmLAZY1基因，擬南芥中的 AtLAZY1 、 AtLPA1基因均參與調(diào)控了葉子或側(cè)枝的著枝角度。在代謝物水平，通常認(rèn)為葉或枝的著枝角度與植物生長(zhǎng)素（ auxin）、油菜內(nèi)脂素（Brassinosteroids，BR）的在組織中的不均勻分布有關(guān)系。 在植物中，一些microRNA也被發(fā)現(xiàn)與auxin調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或者分蘗角度相關(guān)，比如，miR393通過(guò)auxin調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響葉與根的形態(tài)結(jié)構(gòu)；miR164可降解轉(zhuǎn)錄因子NAC1轉(zhuǎn)錄本，從而下調(diào)植物對(duì)auxin的響應(yīng)水平，抑制植物側(cè)根的發(fā)育；auxin響應(yīng)基因ARF8、ARF6在大部分物種中被miRNA167調(diào)控；水稻中，過(guò)表達(dá)miR160，水稻分蘗角度增大。 目前，油菜中對(duì)分蘗角度的研究還比較少，本研究組之前基于F2群體，使用BSA混池性狀座位定位策略，鑒定到了一個(gè)與auxin合成相關(guān)，且可能參與了側(cè)枝著枝角度調(diào)控的基因BnaYUCCA6。 該研究通過(guò)對(duì)分枝角度有顯著差異的兩種油菜品系進(jìn)行mRNA與microRNA高通量測(cè)序，來(lái)進(jìn)一步探討油菜中與分蘗角度相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制。   材料與方法 材料： 油菜品系6098B（較大分枝角度，約52度） 油菜品系Purler（較小分支角度，約22度） 方法： 測(cè)序類(lèi)型：mRNA、microRNA高通量測(cè)序 測(cè)序平臺(tái)：illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái) 取樣方法：兩個(gè)品系的均取抽薹時(shí)期與花發(fā)育早期兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分枝發(fā)生部位。每個(gè)品系每個(gè)時(shí)期1個(gè)樣本（每個(gè)個(gè)體至少取5個(gè)分枝發(fā)生部位，最多6個(gè)個(gè)體混樣樣本），總共4個(gè)樣本，每個(gè)樣本分別進(jìn)行mRNA測(cè)序與microRNA測(cè)序 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)：百邁云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（http://www.dustyhill.net/） Figure 1 技術(shù)路線(xiàn) 結(jié)果：mRNA測(cè)序與分析 a）每個(gè)樣本測(cè)序得到~6Gbase 可用數(shù)據(jù)，與參考基因組比對(duì)率~80%。 b）差異表達(dá)基因篩選（EBseq，F(xiàn)DR < 0.05 & |FC|>2)：如圖2A所示，抽薹期，兩個(gè)品系間檢測(cè)得到5908個(gè)差異表達(dá)基因；花發(fā)育早期，兩個(gè)品系間檢測(cè)到5397個(gè)差異表達(dá)基因。其中3261個(gè)為兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有差異表達(dá)基因。 c）對(duì)上述3261個(gè)共有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，如圖2B所示，差異基因在biological adhesion、biological phase、and locomotion、 macromolecular complex、cell junction、and nucleoid 、nuclear and protein binding transcription factor activity and receptor activity等GO term上有顯著富集。 d）對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，其中3297個(gè)基因注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù) ，其中大多數(shù)基因注釋到了 ribosome 、oxidative phosphorylation相關(guān)代謝通路。值得注意的是，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別有58、51個(gè)差異基因注釋到了植物激素信號(hào)通路，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些通路大多為BR或auxin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該部分結(jié)果如圖3所示。 Figure...

09月30

發(fā)布于 15:46 最新文章, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Biochemical and Comparative Transcriptomic?Analyses Identify Candidate Genes Related to?Variegation Formation in Paeonia rockii PMID:?28817092 雜志：Molecules 影響因子：2.861 研究背景：牡丹是木本灌木，芍藥屬牡丹組，是一種重要的傳統(tǒng)觀賞植物，花瓣大而有吸引力。在十個(gè)牡丹野生種中P. rockii（紫斑牡丹）白色花瓣的基部有明顯的黑色彩斑，而P. ostii（鳳丹）沒(méi)有花瓣雜色。花的顏色是牡丹的一個(gè)重要的商業(yè)特性，花瓣顏色的多樣性可提高牡丹的觀賞價(jià)值，因此闡明P. rockii中紫斑的形成機(jī)制具有重要意義。眾所周知，牡丹的基因很大組（13–16 GB），往往具有較高的雜合度和配子體自交不親和性，在缺少完整的基因組序列的情況下，RNA測(cè)序技術(shù)是獲得基因組表達(dá)信息最有效的工具。到目前為止，幾個(gè)花青素生物合成相關(guān)基因在牡丹中已確定，但是色斑形成的分子機(jī)制還不清楚。 材料方法： 取P. rockii (PR)，P. ostii?(PO)和PR與PO的雜交F1代（RO），分別收集4月底到五月初5個(gè)不同開(kāi)放階段的三種牡丹的花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取階段5（完全開(kāi)放期）的花瓣進(jìn)行形態(tài)解剖分析和色素含量分析。 技術(shù)路線(xiàn)： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 花瓣顏色測(cè)量，形態(tài)解剖分析和色素含量分析 為了確定色斑性狀的遺傳背景，利用PO和PR雜交產(chǎn)生F1植株（RO），所有60株F1植株在花瓣的基部都有色斑存在（Figure 1），PR的彩斑呈顯性遺傳。根據(jù)英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡（RHSCC），在階段5的PR和RO的背景與PO花瓣一樣為白色，而在第5階段的PR和RO的色斑顏色有差異。PR色斑為深紫色，而RO的為紫紅色。 Figure 1.?Fully open flowers of individuals selected for sequencing. 為了闡明其色斑形成的機(jī)制，作者檢測(cè)了色素在PR, PO和RO花瓣中的空間位置。在非色斑花瓣中沒(méi)有色素細(xì)胞（Figure 2C，I，L）。相反，色素細(xì)胞主要位于色斑花瓣的上、下表皮和柵欄組織中（Figure 2F，O）。色素細(xì)胞在PR的雜色相應(yīng)也位于表皮內(nèi)（正面），這可能有助于PR色斑更深的顏色（圖左）。在非雜色花瓣中，表皮細(xì)胞是無(wú)色的（圖2A，B，G - K）。 Figure 2.?Cellular features of the flower materials. HPLC分析表明，在P. rockii和F1代牡丹花瓣的色素中含有四種花青素（CY3G5G，CY3G，芍藥色素（Pn）3G5G和Pn3G）。PR的色斑顯示出“Cy > Pn”的表型，CY3G是含量最高的花青素(28.36 ±...

09月01

發(fā)布于 11:32 最新文章, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

小RNA和降解組聯(lián)合測(cè)序揭示microRNA調(diào)節(jié)茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成 Combined small RNA and degradome?sequencing reveals complex microRNA?regulation of catechin biosynthesis in tea?(Camellia sinensis) ? 雜志：PLOS ONE 影響因子：2.806 PMID:?28225779   研究背景 MicroRNAs是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，在動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及其他生物學(xué)過(guò)程中有至關(guān)重要的作用?；趬A基互補(bǔ)配對(duì)機(jī)制，miRNAs主要通過(guò)直接切割目標(biāo)mRNA和抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄這兩種方式調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。前期研究表明，miRNA參與多種植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程，如：根、葉、花的形態(tài)發(fā)生，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激素反應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)代謝等。植物miRNAs主要通過(guò)克隆、生物信息預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序和Northern 雜交的方法來(lái)檢測(cè)。最常用的技術(shù)是高通量測(cè)序，不僅經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，而且在低豐度的情況下可以更簡(jiǎn)單、快速獲得大量miRNAs。植物中miRNA主要是通過(guò)切割目標(biāo)基因或者抑制目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，所以目標(biāo)基因的確定對(duì)miRNA功能的分析至關(guān)重要。miRNAs目標(biāo)基因的預(yù)測(cè)可以通過(guò)生物信息的方法，目標(biāo)基因的鑒定主要通過(guò)降解組測(cè)序和5’-RLM-RACE方法（RNA連接酶介導(dǎo)的5'cDNA末端的快速擴(kuò)增），這兩種方式還能鑒定miRNA目標(biāo)基因切割位點(diǎn)，有助于miRNA功能分析。 茶樹(shù)（Camellia sinensis），富含兒茶素，是風(fēng)靡全球的非酒精飲料之一。兒茶素是茶葉中重要的組成部分，包括脂型兒茶素（如：ECG和EGCG）和非脂型兒茶素（如：EC和EGC）。EGCG是茶葉中含量最豐富的兒茶素并且具有較強(qiáng)的抗癌效果，可以制約癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制雄激素受體的功能并調(diào)控癌細(xì)胞的生存，血管的生成和移動(dòng)?；谒麄兊姆肿訕?gòu)成，兒茶素可以分為簡(jiǎn)單兒茶素和脂型兒茶素。在兒茶素的合成過(guò)程中有許多酶的參與，如查耳酮合酶（CHS），查爾酮異構(gòu)酶（CHI），黃烷酮醇4-還原酶（DFR），花青素合酶（ANS），花青素還原酶（ANR）和類(lèi)黃酮3,5羥基化酶（F3’5’H）。MiRNA被鑒定為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，并且裂解目標(biāo)mRNA是植物中基因表達(dá)的主要調(diào)控方式。 在茶樹(shù)中，雖然通過(guò)高通量測(cè)序和芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多保守的以及新的miRNAs，但是miRNAs直接調(diào)控兒茶素生物合成還沒(méi)有明確的定義。此項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)高通量測(cè)序鑒定茶葉中保守的以及新的miRNAs，再通過(guò)5’-RLM-RACE方法分析潛在的目標(biāo)miRNAs。通過(guò)表達(dá)模式分析進(jìn)一步篩選兒茶素積累過(guò)程中潛在的miRNAs。結(jié)合5’-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)和表達(dá)模式分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些新的調(diào)節(jié)兒茶素生物合成途徑中基因切割的調(diào)控因子。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)材料 茶樹(shù)1005，取葉片（包括芽，第一葉，第二葉，第三葉，第四葉，第五葉，成熟葉），進(jìn)行混合，提取總RNA。 茶樹(shù)1005，取葉片（包括第一葉，第三葉，成熟葉），進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析和兒茶素含量測(cè)定。 測(cè)序平臺(tái)：Illumina?HiSeq 2500?（Biomarker Technology Co.） 技術(shù)路線(xiàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.茶葉中miRNA的初步分析 從提取的總RNA中構(gòu)建smallRNA文庫(kù)，測(cè)序質(zhì)控后得到19，567，691條clean reads，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)有18.83%的rRNA，1.23%的tRNA，0.01%的small nuclear RNA，0.07%的重復(fù)序列，其中79.85%的序列沒(méi)有功能注釋?zhuān)梢詫⑦@些沒(méi)有功能注釋的序列用來(lái)做下一步的miRNA的預(yù)測(cè)和鑒定。根據(jù)smallRNA的測(cè)序長(zhǎng)度分布圖可以得出，miRNA的長(zhǎng)的主要分布在20-25nt之間，豐度最高的是24nt（47.89%）。這個(gè)長(zhǎng)度分布和其他栽培茶以及其他植物報(bào)道的結(jié)果非常相似。 2.茶葉中保守miRNAs的鑒定 將沒(méi)有功能注釋的clean reads與miRBase（植物已知保守miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，共獲得69個(gè)保守的miRNAs，分別屬于62個(gè)家族。根據(jù)長(zhǎng)度分布發(fā)現(xiàn)，這些保守的miRNAs的長(zhǎng)度主要集中在18-25nt之間，長(zhǎng)度主要集中在24nt（46.385），其次是21nt。 對(duì)高通量測(cè)序的miRNA片段進(jìn)行分析，鑒定的保守miRNA中，read values低于1000的占91.3%的比例，其中read values低于10的占56.52%的比例。研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些高表達(dá)(read values大于1000)的miRNA家族，如miR165a和miR396a。另外，在不同家族中的miRNAs表達(dá)量差異較大，并且在同一家族中各miRNAs之間的表達(dá)量也有較大差異。這些數(shù)據(jù)表明，不同家族miRNA的表達(dá)模式不同，意味著不同的miRNAs在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用不一樣。 3.茶葉中新miRNAs的鑒定 通過(guò)miRDeep2和Mfold軟件分析，共鑒定出47個(gè)新的miRNAs，進(jìn)一步對(duì)這些新miRNA進(jìn)行片段長(zhǎng)度和表達(dá)量分析。新miRNA跟保守miRNA長(zhǎng)度分布相似，主要集中在18-25nt之間，最集中的長(zhǎng)度是24nt和21nt。另外，新miRNA的表達(dá)量比保守miRNA的低，新miRNA中表達(dá)量最高的只有4517個(gè)read values。   研究人員將這些新的miRNA與其他植物中已知的miRNA進(jìn)行比對(duì)，揭示了許多同系物。除了三個(gè)miRNA歸為同一個(gè)家族外，絕大多數(shù)的miRNA可以被分為獨(dú)立的家族。研究者還對(duì)新miRNA的前體進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)他們都有一個(gè)發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度在84-114bp。 4.GO功能富集和KEGG通路分析目標(biāo)miRNA 為了研究茶樹(shù)miRNA的功能，研究人員運(yùn)用TargetFinder軟件和轉(zhuǎn)錄序列對(duì)上述miRNA進(jìn)行目標(biāo)基因預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，其中97個(gè)miRNA對(duì)644個(gè)目標(biāo)基因有調(diào)控作用。再將644個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析：GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些目標(biāo)基因主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、連接活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、新陳代謝和細(xì)胞進(jìn)程等功能條目；KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)366個(gè)目標(biāo)基因參與36個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，主要參與糖酵解、檸檬酸循環(huán)、氨基酸代謝、光合作用、脂肪酸代謝、嘌呤嘧啶代謝、氧化磷酸化、植物病原體相互作用、初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物過(guò)程。 miRNA靶向基因降解組測(cè)序和功能分析 為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)和鑒定miRNA靶向基因，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了降解組文庫(kù)并進(jìn)行深度測(cè)序，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和上述獲得的miRNAs，通過(guò)TargetFinder軟件預(yù)測(cè)到216個(gè)靶向基因被97個(gè)miRNAs調(diào)控。在這些靶向基因中，降解組測(cè)序鑒定了26個(gè)基因的26個(gè)切割位點(diǎn)，被16個(gè)miRNA家族的19個(gè)miRNAs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，如表1。 表1.通過(guò)降解組測(cè)序鑒定茶樹(shù)1005中miRNA靶向基因 基于5’-RLM-RACE技術(shù)對(duì)目標(biāo)斷裂位點(diǎn)的驗(yàn)證 研究人員采用5’-RLM-RACE的方法，對(duì)其中5個(gè)有注釋的miRNA（來(lái)自降解組測(cè)序）切割位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，目標(biāo)基因comp152929被csn-miR396a1 和?csn-miR396a2共同調(diào)控，切割位點(diǎn)在目標(biāo)基因的第11-12個(gè)核苷酸處；兩個(gè)基因comp159882和comp157894同時(shí)被miRNA167a調(diào)控，且有共同的切割位點(diǎn)，在目標(biāo)基因的第11-12個(gè)核苷酸處；另外，miRNA394a調(diào)控comp156493，切割位點(diǎn)有兩處，分別為第10-11，17-18個(gè)核苷酸處；同樣的，novel-miR2調(diào)控comp145093，切割位點(diǎn)也有兩處，分別為第10-11，12-13個(gè)核苷酸處。5’-RLM-RACE的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些降解組分析的結(jié)果，另外一些切割位點(diǎn)有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。 7.茶葉中miRNA的表達(dá)模式分析 對(duì)茶樹(shù)1005葉片兒茶素含量的研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素在不同葉片中的的含量由高到低排序?yàn)椋旱谝蝗~，芽，第二葉，第三葉，成熟葉。第一葉，第三葉和成熟葉的兒茶素含量有顯著差異。 為了探索茶葉中miRNAs與兒茶素合成相關(guān)性，研究人員采用qRT-PCR的方法分析第一葉、第三葉以及成熟葉中miRNA（read values高于平均值）表達(dá)。通過(guò)表達(dá)模式的成簇分析將這些miRNA分成三組。第一組，miRNA表達(dá)模式與兒茶素含量成正相關(guān)，分別有novel-miR10, novel-miR13, novel-miR19, csn-miR165a, csn-miR170, csn-miR2593e 和novel-miR12；第二組，miRNA表達(dá)模式與兒茶素含量成負(fù)相關(guān)，分別有novel-miR1, novel-miR2, csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和csn-miR396a；第三組，miRNA表達(dá)模式與兒茶素含量沒(méi)有顯著相關(guān)性，有csn-miR4380a。 8.調(diào)控兒茶素生物合成基因miRNA的鑒定 為了深入了解miRNA在調(diào)控兒茶素合成代謝中的功能，研究人員將高通量測(cè)序獲得的miRNA跟NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)以及RNA測(cè)序的兒茶素生物合成相關(guān)基因的mRNA進(jìn)行BLAST，預(yù)測(cè)可能的miRNA。為了消除假陽(yáng)性，對(duì)預(yù)測(cè)的斷裂位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過(guò)5’-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了6個(gè)可能參與兒茶素生物合成功能基因表達(dá)調(diào)控的miRNA。它們分別是csn-miRNA167a、f...

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