文章題目：High-resolution temporal dynamic transcriptome landscape reveals a GhCAL-mediated flowering regulatory pathway in cotton (Gossypium hirsutum L.)

發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal

發(fā)表時間：2020年7月12

影響因子：8.1

研究內(nèi)容：棉花花芽分化

研究對象：兩個早熟品種，兩個晚熟品種；每個品種6個時期

研究方法：轉(zhuǎn)錄組測序

前言

陸地棉(Gossypium hirsutum L.)是世界上最重要的纖維作物。在我國黃河流域和長江流域棉區(qū)，實現(xiàn)早熟棉在小麥或者油菜后直播可以提高復(fù)種指數(shù)。而在西北內(nèi)陸棉區(qū)，春季氣溫低，秋季枯霜早，早熟棉既能提高棉花的霜前花率，還可以改善棉花品質(zhì)?；ㄑ糠只怯绊懚碳久奁贩N早熟的重要性狀，是棉花現(xiàn)蕾期、開花期和成鈴期發(fā)育的基礎(chǔ)，花芽分化直接影響開花時間?；ㄑ糠只侵参飶臓I養(yǎng)生長向生殖生長過渡的標(biāo)志。當(dāng)進入生殖生長時，側(cè)芽變成花芽，花芽發(fā)育成果枝。果枝分化決定了開花量、生殖能力和棉花產(chǎn)量。因此，早熟性狀及早熟棉品種在生產(chǎn)上顯得尤為重要。

結(jié)果

1、棉花莖尖的形態(tài)發(fā)育

圖1兩個早熟品種和兩個晚熟品種的比較

2、棉花不同發(fā)育階段的72個RNA文庫的轉(zhuǎn)錄組譜

?圖2早熟和晚熟品種六個發(fā)育階段之間的轉(zhuǎn)錄關(guān)系。

3、加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）

?圖3差異表達基因的WGCNA

4、棉花從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的鑒定

?圖4模塊MElightcyan的分析

5、GhCAL在調(diào)節(jié)從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)換的功能驗證

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摘要
Bax抑制劑-1（BI-1）是真核生物中進化保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），定位細(xì)胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物脅迫的能力在擬南芥中得到了充分研究，而小麥中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在這項研究中，將禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥進行RNA-seq分析，然后分離小麥BI-1基因TaBI-1.1。通過水楊酸（SA）處理誘導(dǎo)TaBI-1.1表達，并通過脫落酸（ABA）處理誘導(dǎo)TaBI-1.1的下調(diào)。基于β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色，TaBI-1.1在成熟葉和根中表達，但不在下胚軸或幼葉中表達。 TaBI-1.1在擬南芥中的組成型表達增強了其對丁香假單胞菌病毒（Pst）DC3000感染的抗性并誘導(dǎo)SA相關(guān)基因表達。此外，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥顯示出由高濃度SA引起的損害的減輕，并降低了對ABA的敏感性。與表型一致，35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析顯示TaBI-1.1參與生物脅迫。這些結(jié)果表明，TaBI-1.1正向調(diào)節(jié)SA信號并在對生物脅迫的響應(yīng)中起重要作用。此外，TaBI-1.1與水通道蛋白TaPIP1相互作用，并且它們都定位于ER膜（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜）。此外，研究人員證明了SA處理后TaPIP1上調(diào)，并且TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥增強了對Pst DC3000感染的抗性。由此表明，在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能發(fā)生在對SA信號和防御反應(yīng)的響應(yīng)中。

材料和方法

使用擬南芥Columbia-0（Col-0）作為TaBI-1.1過表達的背景， 突變體atbi1-2從擬南芥生物資源中心（ABRC）獲得。 從栽培的小麥品種小白麥擴增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA， 將PCR產(chǎn)物克隆到pLB載體中，使用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列同一性比較。
RNA-Seq Analysis
收集來自4周齡Col-0和轉(zhuǎn)基因系35S :: TaBI-1.1的葉片用于RNA-seq分析，使用HiSeq 2500平臺測序。測序數(shù)據(jù)與TAIR 10擬南芥參考基因組比對。使用TopHat和Cufflink軟件包進行mRNAseq數(shù)據(jù)分析以及DEG的鑒定和分析。通過GOseq軟件進行差異表達基因的GO富集分析。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫通路進行KEGG富集分析，尋找差異表達基因的富集通路。在百邁客云平臺（BMKCloud）完成小麥Fg處理的RNA-seq數(shù)據(jù)下載和分析， SRA數(shù)據(jù)庫（登錄號：PRJNA289545）。
其他實驗：1.qRT-PCR分析；2.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在脅迫處理下的應(yīng)答及性狀評價；3.β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）活性測定；4.細(xì)菌接種和細(xì)菌生長的監(jiān)測；5.酵母雙雜交系統(tǒng)；6.Pull-Down assay（免疫沉淀法）；7.亞細(xì)胞定位測定；8.ELISA Assay（酶聯(lián)免疫吸附試驗）

分析結(jié)果
1.通過qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色確定TaBI-1.1的表達模式
研究人員分析了來自Fg處理的小麥RNA-seq數(shù)據(jù)，以研究植物防御信號通路。從RNA-seq分析中分離出前10個差異表達基因。在這10個基因中鑒定了兩個小麥BI-1基因：TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名為TaBI-1。在小麥Ensembl數(shù)據(jù)庫中僅篩選出三種BI-1基因：TaBI-1，TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在兩個差異表達的BI-1基因中， TaBI-1.1的差異最大。根據(jù)氨基酸比對，TaBI-1.1與TaBI-1同一性達到99.19％。與對照相比，F(xiàn)g處理對TaBI-1.1的表達水平上調(diào)24倍。許多關(guān)于AtBI-1的研究已經(jīng)證實AtBI-1在植物中對生物和非生物脅迫的抗性中起關(guān)鍵作用。 TaBI-1.1蛋白的序列與AtBI-1有69.88％的同一性，表明該序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR監(jiān)測TaBI-1.1的表達模式以確定TaBI-1.1在生物和非生物脅迫中可能的作用。TaBI-1.1的表達在響應(yīng)SA處理時顯著上調(diào)，在響應(yīng)ABA處理時下調(diào)。 SA處理48小時后TaBI-1.1表達達到8倍高峰（圖1A）。 響應(yīng)ABA處理的下調(diào)水平在8小時達到初始水平的約1/5（圖1C）。 響應(yīng)NaCl處理，表達水平在4小時后下降，在2小時稍微增加并且在8小時后回到其初始水平（圖1B）。
研究者創(chuàng)建了含有1.7kb TaBI-1.1啟動子并生成轉(zhuǎn)基因擬南芥的PBI :: GUS融合構(gòu)建體，以研究TaBI-1.1的空間表達模式。使用GUS染色測定組織GUS活性。在成熟葉和根中有TaBI-1.1表達，但在下胚軸和幼葉中觀察不到（圖1D）。還檢測了各種小麥組織中的TaBI-1.1表達水平，包括根，莖，葉和小穗，結(jié)果表明TaBI-1.1的表達在這些小麥組織中普遍存在，而且在葉中最高，在小穗中最低（圖1I）。在SA和NaCl處理之后，成熟葉中的表達與對照相比增加，并且SA處理的表達更高。當(dāng)SA和NaCl處理時，在下胚軸中也檢測到表達（圖1E，F(xiàn)）。在ABA處理的植物的葉子中檢測到較弱的表達（圖1G）。通過qRT-PCR進一步證實GUS表達水平（圖1H）。以上結(jié)果表明，TaBI-1.1在各種脅迫下均有表達。

圖1. 通過qRT-PCR和GUS染色評估TaBI-1.1的相應(yīng)表達模式

2.TaBI-1.1的表達增強了擬南芥對Pst DC3000感染的抗性
經(jīng)過Fg和SA處理后表達上調(diào)，假設(shè)TaBI-1.1可能參與生物脅迫反應(yīng)。研究人員在擬南芥中異位表達TaBI-1.1，在花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子的控制下驗證這一假設(shè)。選擇兩個TaBI-1.1表達水平相對較高的純合株系3和7（35S :: TaBI-1.1＃1和35S :: TaBI-1.1＃2）用于進一步分析（圖2A）。將atbi1-2，Col-0和兩個轉(zhuǎn)基因品系的四周齡葉子進行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2處理（模擬物）。在模擬實驗中，在用10mM MgCl 2處理3天后，在atbi1-2，Col-0和兩個轉(zhuǎn)基因品系的葉中沒有觀察到明顯差異（圖2B）。在用600nm（OD600）0.002的光密度接種Pst DC3000，3天后在這些葉中檢測到疾病癥狀。 atbi1-2突變體表現(xiàn)出的癥狀較嚴(yán)重，因為幾乎所有的葉片都表現(xiàn)出嚴(yán)重的萎黃和壞死，而兩種轉(zhuǎn)基因品系表現(xiàn)出比atbi1-2和Col-0更輕微的疾病癥狀。轉(zhuǎn)基因植物的一小部分葉子是綠色的，沒有表現(xiàn)出萎黃和壞死。 Col-0葉中疾病癥狀的程度介于atbi1-2和兩個轉(zhuǎn)基因品系之間（圖2C）。在接種Pst DC3000或10mM MgCl 2（模擬物）后24小時監(jiān)測SA水平。在模擬組中，在35S :: TaBI-1.1＃1中觀察到最高的SA水平，且顯著高于Col-0。在Pst DC3000處理下，與Col-0相比，在兩個轉(zhuǎn)基因品系中檢測到顯著較高的SA水平，并且在四種基因型中35S :: TaBI-1.1＃1含有最高的SA水平。 Col-0和atbi1-2之間的差異也達到了顯著水平（圖2D）。在0和3dpi時測量 atbi1-2，Col-0和兩個轉(zhuǎn)基因品系的葉片中的細(xì)菌滴度。在初始接種量（0dpi）中，在四種基因型中沒有觀察到致病細(xì)菌生長的顯著差異。在3dpi時，兩種轉(zhuǎn)基因品系的細(xì)菌滴度明顯低于Col-0，Col-0的細(xì)菌滴度也明顯低于atbi1-2，表明兩種轉(zhuǎn)基因品系對致病細(xì)菌的生長有較強的抑制作用，并且atbi1-2比Col-0更容易感染病原菌（圖2E）?；趦蓚€轉(zhuǎn)基因株系中較高水平的35S :: TaBI-1.1＃1，使用35S :: TaBI-1.1＃1來進一步檢測PR1的表達。高SA水平誘導(dǎo)PR基因的表達以增強植物對病原體攻擊的抗性。 PR1表達的增加或許可以解釋對Pst感染抵抗力的增強（圖2F）。

圖2. TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥對Pst DC3000的抗性增強

3.TaBI-1.1正向調(diào)節(jié)的SA相關(guān)基因表達
PR基因表達與SA積累和系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）有關(guān)。進一步檢測了常規(guī)條件下生長2周齡Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1＃1幼苗中SA相關(guān)基因的表達。與Col-0和atbi1-2相比，在35S :: TaBI-1.1中觀察到PR1，PR5，ICS1和EDS1有顯著高表達水平。 然而，在這些基因表達水平中Col-0和atbi1-2之間沒有檢測到顯著差異（圖3）。 與Col-0相比，35S :: TaBI-1.1中PR1和PR5的表達水平分別增加了約11倍和9倍。 PR2，ICS1和EDS1表達的倍數(shù)變化低于PR1和PR5表達的變化（圖3）。因此，TaBI-1.1上調(diào)PR1，PR2，PR5，ICS1和EDS1基因的表達，表明 TaBI-1.1在SA信號傳導(dǎo)中起正向調(diào)節(jié)作用。

圖3. 通過qRT-PCR檢測正常條件下生長的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB1-1.1 2周齡幼苗中5個SA相關(guān)基因的表達水平。

4.TaBI-1.1降低了SA和ABA的敏感性
將Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1的4日齡幼苗置于含有不同濃度SA，NaCl和ABA的MS培養(yǎng)基中，以研究Col- 0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在苗期響應(yīng)SA和其他脅迫處理的不同表型。 13天后監(jiān)測到形態(tài)學(xué)變化。在沒有生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上（MS0），在任何兩種基因型的Col-0，atbi1-2和兩種35S :: TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因品系之間沒有觀察到顯著差異的根長，側(cè)根或鮮重（圖4A，E-G）。在補充有30μMSA的MS培養(yǎng)基上，atbi1-2與Col-0在鮮重，根長和側(cè)根數(shù)量上顯示出較大的差異（圖4H-J）。 35S :: TaBI-1.1＃2的側(cè)根數(shù)也與Col-0的側(cè)根數(shù)顯著不同（圖4J）。在含有30μMSA的MS培養(yǎng)基上生長的植物中，Col-0的異常生長程度介于atbi1-2和35S :: TaBI-1.1之間（圖4H-J）。高濃度SA會增加H2O2的積累并導(dǎo)致氧化損傷。當(dāng)置于含有50μMSA的MS培養(yǎng)基上時，幼苗顯示更明顯的生長畸形。這些結(jié)果顯示，在SA濃度較高的情況下，幼苗遭受更嚴(yán)重的SA脅迫。用高濃度SA處理的葉子比用MS0培養(yǎng)基處理的葉子綠色淺，黃色淡和葉子小（圖4B）。在含有50μMSA的MS培養(yǎng)基上生長的35S :: TaB1-1.1＃1的根長顯著長于Col-0（圖4K）。35S :: TaBI-1.1＃1的鮮重和側(cè)根數(shù)與Col-0相比顯著增加（圖4L，M）。因此，SA不僅影響葉子的大小和顏色，而且影響根長，鮮重和側(cè)根數(shù)。
此外，研究人員檢查了在含有NaCl和ABA的MS培養(yǎng)基上生長的幼苗的表型。 在含有100和120mM NaCl的MS培養(yǎng)基上生長的植物之間沒有觀察到顯著差異（圖4C，N-S）。在用20μMABA處理后，atbi1-2的畸形程度比 Col-0和35S :: TaBI-1.1更明顯（圖4D）。 根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，atbi1-2與Col-0相比在根長，鮮重和側(cè)根數(shù)上顯示出顯著差異，表明atbi1-2對ABA更敏感（圖4T-V）。 然而， 30μMABA處理中未觀察到根長，鮮重或側(cè)根數(shù)的明顯差異（圖4W-Y）。 因此，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥對高濃度SA表現(xiàn)出降低的敏感性，并且atbi1-2突變體對ABA表現(xiàn)出增加的敏感性。

圖4. 在含有SA，NaCl或ABA的MS培養(yǎng)基上生長的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB-1.1幼苗根長，鮮重和側(cè)根數(shù)的統(tǒng)計分析。

研究者進一步研究了TaBI-1.1在發(fā)芽過程中對ABA的敏感性。 在不同濃度的ABA的培養(yǎng)基上每12小時記錄發(fā)芽種子的百分比。在MS0培養(yǎng)基中，Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥植物顯示相似的發(fā)芽率（圖5A）。 含有0.5μMABA的培養(yǎng)基中，兩種轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)顯著快于Col-0和atbi1-2（圖5B）。 在含有1μMABA的培養(yǎng)基上觀察不到顯著差異（圖5C）。 在含有2μMABA的培養(yǎng)基上，Col-0和兩種轉(zhuǎn)基因品系也比atbi1-2稍快地萌發(fā)（圖5D）。 以上結(jié)果表明，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA的敏感性較低。

圖5. TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥在萌發(fā)過程中對ABA的敏感性降低。

5.擬南芥RNA-Seq分析中TaBI-1.1的表達
研究人員對35S :: TaBI-1.1＃1和Col-0植物進行了RNA-seq分析，以更好地理解TaBI-1.1功能。鑒定出48個上調(diào)基因和58個下調(diào)基因并做了一個熱圖。使用GO分析將差異表達的基因功能分類。富集了30多個GO terms，如圖6所示。對于上調(diào)的基因，富集的GO terms主要集中在抗生物脅迫，細(xì)胞免疫應(yīng)答和SA合成與代謝相關(guān)的生物過程上。前10個關(guān)鍵的Go terms分別是防御反應(yīng)、對外部刺激的反應(yīng)、對生物刺激的反應(yīng)、對外部生物刺激的反應(yīng)、多生物體過程、對另一個生物體的反應(yīng)、對另一個生物體的防御反應(yīng)、對壓力的反應(yīng)、單一生物體代謝過程和對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)（圖6A）。對于下調(diào)的基因，富集的GO terms集中在細(xì)胞組分上，并且前三項是細(xì)胞組分，膜和細(xì)胞周圍（圖6B）。選擇七個上調(diào)基因和三個下調(diào)基因進行qRT-PCR實驗，結(jié)果表明，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq分析一致。

圖6. 使用RNA-seq分析GO terms在35S :: TaBI-1.1和Col-0之間差異表達的基因的富集

KEGG富集分析差異表達基因被呈現(xiàn)為散點圖。 使用富集因子、q值和通路中富集的基因數(shù)量來測量富集程度。 富集因子越高表示富集程度越高。觀察到上調(diào)基因富集了20多個KEGG通路。上調(diào)基因的前20個富集通路中，其中光合作用是最明顯的富集途徑（圖7A）。 光合作用的富集因子達到0.09，而q值大約為0。相反，下調(diào)基因的KEGG富集通路并不明顯，只有6個富集因子較低的通路被鑒定出來（圖7B）。因此，TaBI-1.1參與對生物脅迫的應(yīng)答并主要通過基因上調(diào)表達來執(zhí)行其防御功能。

圖7. 35S :: TaBI-1.1和Col-0差異表達基因的KEGG富集分析

6.TaBI-1.1與TaPIP1相互作用并在ER膜上與TaPIP1共定位
將TaBI-1.1置于PGBKT7（BD）載體中，用作誘導(dǎo)蛋白在酵母雙雜交實驗中篩選小麥cDNA文庫，以進一步探索TaBI-1.1調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞機制。 結(jié)果，鑒定出一個候選的相互作用物質(zhì)，水通道蛋白TaPIP1。 使用酵母雙雜交和pull-down測定來確定TaBI-1.1和TaPIP1之間在體內(nèi)和體外的相互作用。將融合TaBI-1.1（BD-TaBI-1.1）的BD載體和融合TaPIP1（AD-TaPIP1）的pGADT7（AD）載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。只有用BD-TaBI-1.1和AD-TaPIP1轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在缺乏Trp，Leu，His和Ade（SD / -Trp-Leu-Ade-His）的選擇性培養(yǎng)基上生長。轉(zhuǎn)換TaBI-1.1和TaPIP1的融合載體產(chǎn)生相同的結(jié)果，表明TaBI-1.1與TaPIP1在酵母細(xì)胞中有相互作用（圖8A）。使用pull-down分析進一步確認(rèn)相互作用（圖8B）。將TaBI-1.1克隆到pCold TM TF表達載體中在大腸桿菌中產(chǎn)生重組蛋白TF-His-TaBI-1.1。通過將序列克隆到pGEX-4T-1載體中，在大腸桿菌中成功產(chǎn)生了重組GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）-TaPIP1蛋白。使用抗His抗體的Western印跡所示，體外pull-down測定顯示TF-His-TaBI-1.1與GST-TaPIP1有物理互作（physically interacted）（圖8B）
AtBI-1定位于ER膜上，研究者在小麥原生質(zhì)體中檢測了TaBI-1.1-GFP和mRFP-HDEL的共定位以確定TaBI-1.1的亞細(xì)胞定位。GFP和mRFP熒光的重疊系數(shù) 是0.69，表明TaBI-1.1與ER膜上的HDEL共定位（圖8C）。 鑒于TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用，研究者還檢測到TaPIP1-GFP和mRFP-HDEL之間的共定位以及TaBI-1.1-GFP和TaPIP1-mRFP在小麥原生質(zhì)體中的共定位（圖8C）。 結(jié)果顯示TaBI-1.1和TaPIP1共定位于ER膜。
通過qRT-PCR檢測響應(yīng)多次處理的TaPIP1的表達水平。 SA，NaCl和ABA處理使TaPIP1表達上調(diào)，這意味著TaPIP1可能參與對生物和非生物脅迫的反應(yīng)（圖8D）。

圖8. TaBI-1.1和TaPIP1的相互作用和亞細(xì)胞定位

7.TaPIP1增加了擬南芥對PstDC3000感染的抗性
為了進一步研究TaBI-1.1和TaPIP1之間相互作用的潛在功能，研究人員構(gòu)建了一個在 CaMV 35S啟動子控制下表達TaPIP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥。選擇了兩個獨立的轉(zhuǎn)基因品系： 35S :: TaPIP1-1和35S :: TaPIP1-2，且TaPIP1的表達水平較高，這通過qRT-PCR分析進行了驗證（圖9A）。鑒于SA處理下TaPIP1水平的上調(diào)，推測TaPIP1也可能參與對病原體感染的響應(yīng)。為了驗證這個想法，研究者在Pst DC3000感染下檢測了TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉表型。在模擬處理下，Col-0和兩個轉(zhuǎn)基因品系的葉片中沒有觀察到差異（圖9B）。在用Pst DC3000接種后，發(fā)現(xiàn)Col-0葉片上明顯的褪綠癥狀，相反，兩種轉(zhuǎn)基因植物的褪綠癥狀較輕（圖9C）。為了進一步證實TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的抗性增加，在0和3dpi測量葉片中的細(xì)菌滴度。如圖9D所示，在初始接種量中Col-0和兩個轉(zhuǎn)基因品系之間沒有顯著差異，但是在3dpi時兩個TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的Col-0的細(xì)菌滴度顯著低于Col-0，表明TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥中病原菌的生長受到很大抑制。因此，TaBI-1.1和TaPIP1在響應(yīng)Pst DC3000感染時表現(xiàn)出類似的作用，并且研究者推測TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能涉及防御反應(yīng)。

圖9. TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥對Pst DC3000表現(xiàn)出增強的抗性

創(chuàng)新點：

BI-1是一種局限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜的細(xì)胞保護蛋白，在對生物和非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。迄今為止，雖然已經(jīng)鑒定了幾種與BI-1相互作用的蛋白質(zhì)。然而，關(guān)于BI-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中機制的認(rèn)知非常有限，BI-1調(diào)節(jié)植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的機制目前尚不清楚，該研究中，通過禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥的RNA-seq數(shù)據(jù)分析確定了小麥BI-1基因TaBI-1.1，揭示了TaBI-1.1和TaPIP1在響應(yīng)病原體感染的ER膜上的相互作用的可能作用。

參考文獻：
Lu P P, Yu T F, Zheng W J, et al. The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1 and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis[J]. Front Plant Sci, 2018, 9:20.

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發(fā)表雜志：Experimental & Molecular Medicine

影響因子：5.063

PMID：28857085

前言

高血壓的患病率不斷增加，正在成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題，但是高血壓的發(fā)病機制還不完全清楚。 腎損傷和功能障礙可能是導(dǎo)致血壓升高的主要原因之一，一些證據(jù)表明 鹽攝取能夠上調(diào)細(xì)胞因子的表達并增加腎臟損傷，但高鹽（HS）攝入與腎損傷發(fā)展之間的關(guān)系尚不清楚。本文研究人員用HS水喂養(yǎng)小鼠持續(xù)8周，并研究由此產(chǎn)生的腸道病理生理變化及其對早期腎臟異常的影響。

材料和方法

使用6至8周齡的雄性特異性無病原體C57BL / 6小鼠。根據(jù)處理方法分為：對照組（飲用水），HS實驗組（飲用水+ NaCl，8周），抗生素實驗組（飲用水+ NaCl+多粘菌素B+新霉素，8周）。

分析內(nèi)容如下：1.微生物分析；2.組織分析；3.基因表達分析，RNA-Seq使用百邁客BioMarker Technologies（Beijing，China）Illumina HiSeq 2500平臺；4.蛋白質(zhì)表達和生化分析；5.FD-4滲透性實驗；6.糞便微生物群移植（FMT）；7.統(tǒng)計分析

分析結(jié)果

1.慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)

首先，研究人員檢查HS攝入是否會影響腸道細(xì)菌。慢性HS喂養(yǎng)后，盲腸中的總細(xì)菌負(fù)荷略有下降，但無顯著變化（圖1a）。慢性HS喂養(yǎng)后，回腸上皮（圖1b）和結(jié)腸腔內(nèi)（圖1b）的細(xì)菌負(fù)荷也降低。慢性HS處理顯著降低厚壁菌門和提高擬桿菌的水平，這表明細(xì)菌組合物在HS攝入后發(fā)生改變。

圖1. 慢性高鹽喂養(yǎng)減少腸內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷

為了研究HS攝入如何影響腸道微環(huán)境，研究人員將HS組的細(xì)菌組成與對照組相比，在HS處理后，盲腸中Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes在門水平和Actinobacteria以及Clostridia和Bacteroidia的百分比顯著不同。unweighted uniFrac分析結(jié)果顯示HS和對照組分別聚集（圖2b）。進一步分析顯示，HS和對照組在回腸粘液層分別聚集（圖2c），而對照組和HS組形成兩個聚類，分離趨勢明顯在結(jié)腸粘液層（圖2d）。研究結(jié)果表明，慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)，細(xì)菌計數(shù)和微環(huán)境組成的變化也證明了這一點。

圖2. 慢性高鹽喂養(yǎng)引起腸道生態(tài)失調(diào)

2.慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致消化道反應(yīng)受損的腸道異常

腸道生態(tài)失調(diào)通常與腸道病理生理學(xué)的改變有關(guān)，研究人員檢查了慢性HS喂養(yǎng)對腸道變化的影響。在對照組和HS-喂養(yǎng)組小鼠的回腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞形態(tài)沒有差異（圖3a）。此外，通過TUNEL和ki67染色鑒定的相似數(shù)量凋亡和增殖細(xì)胞表明，慢性HS喂養(yǎng)不影響腸道中的細(xì)胞死亡（圖3a）。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)志物表達被慢性HS攝入顯著改變。特別是，Ccl4，Ccl5和Ifn-γ在HS小鼠的回腸中表現(xiàn)出更高的mRNA水平（圖3b）。 IFN-γ免疫組織化學(xué)在回腸中的結(jié)果證實了基因表達數(shù)據(jù)（圖3c）。由于TLR家族蛋白和Nf-κB是參與病原體相關(guān)免疫應(yīng)答的主要分子，進一步評估TLR家族和Nf-κB基因表達，發(fā)現(xiàn)TLR2，TLR3和TLR5mRNA水平在回腸中趨于更高（圖3d）。同時，HS處理后IRF7，GATA3和NFKB2的表達顯著上調(diào)（圖3e）。此外，HS喂養(yǎng)后白細(xì)胞中CD38的表達在回腸中升高（圖3f）。然后通過RNA測序進行轉(zhuǎn)錄組分析，并比較涉及“細(xì)胞因子 – 細(xì)胞因子受體相互作用”，“ NF-κB信號通路“和”Toll樣受體信號通路“。在回腸和結(jié)腸中，兩組之間許多基因的表達是不同的?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明慢性HS攝入導(dǎo)致腸炎癥反應(yīng)中斷。

圖3. 慢性高鹽喂養(yǎng)與腸道炎癥反應(yīng)中斷有關(guān)

3.慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸屏障功能喪失并促進細(xì)菌易位進入腎臟

腸道免疫反應(yīng)受損始終與腸道屏障功能障礙有關(guān)，研究人員研究了HS的攝入如何影響腸道屏障功能。HS攝入顯著降低了tjp-1，tjp-2，claudin-1，claudin-7和claudin-8基因的表達（圖4a）。 此外，與對照小鼠相比，HS攝入后，回腸和結(jié)腸中屏障形成的緊密連接ZO-1蛋白水平和結(jié)腸中的Occludin蛋白水平顯示出較低的趨勢（圖4c和d）。 另一方面，在HS喂養(yǎng)回腸和結(jié)腸后，成孔緊密連接蛋白Claudin-2蛋白水平顯著較高（圖4c和d）。這些數(shù)據(jù)清楚地表明腸道腸道屏障被慢性HS攝入所破壞。

腸道通透性增加可能導(dǎo)致腸道細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物易位至腸外組織。通過使用16s PCR來識別細(xì)菌DNA，檢測到腎臟，肝臟和脾臟中的細(xì)菌移位。有趣的是，慢性HS攝入特異性促進了細(xì)菌移位進入腎臟，但不能進入肝臟或脾臟（圖4e）。進一步分析了腎細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)與基于LEfSe測量的對照相比，屬于腸道細(xì)菌的桿菌被發(fā)現(xiàn)在HS處理的腎中富集（圖4f）。特別是，與對照動物的腎臟相比，在HS喂養(yǎng)的腎臟中，芽孢桿菌和Planomicrobium的水平分別增加2.6倍和8.7倍。這些結(jié)果表明慢性HS攝入可以促進某些細(xì)菌的易位。該數(shù)據(jù)清楚地表明HS喂養(yǎng)與腸道屏障破壞和腸道細(xì)菌易位進入腎臟有關(guān)。

圖4. 慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致腸道屏障功能障礙并促進細(xì)菌移位進入腎臟

4.慢性高鹽喂養(yǎng)相關(guān)的腸屏障破壞和腎損傷取決于腸道微生物群

為了進一步闡明HS攝入后腸道生態(tài)失調(diào)和腎損傷之間的關(guān)系，給小鼠喂養(yǎng)多粘菌素B和新霉素?？股亟o藥確實恢復(fù)了HS飼喂誘導(dǎo)的回腸Ifn-γ過表達，通過糞便白蛋白和FD-4滲透監(jiān)測腸道泄漏，以及通過血漿內(nèi)毒素水平和腎臟16s / 18s比率監(jiān)測的細(xì)菌移位，通過尿和血漿Na +濃度測量，抗生素不改變鈉負(fù)荷（圖5a）。雖然8周HS喂養(yǎng)并未引起纖維化等進展性腎損傷，但由col1a1 mRNA水平監(jiān)測（圖5b），HS喂養(yǎng)增加了血漿肌酐水平。更重要的是，與對照組小鼠相比，HS-喂養(yǎng)小鼠腎功能障礙的主要標(biāo)志物尿白蛋白/肌酐比率顯著增加，抗生素治療幾乎可以完全恢復(fù)腎功能（圖5d）。另外，TUNEL染色顯示抗生素施用可以降低HS誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的升高（圖5e和f）。總之，該數(shù)據(jù)表明，抗生素治療能夠改善腸道滲漏和HS喂養(yǎng)引起的早期腎損傷。

圖5. 抗生素改善慢性高鹽喂養(yǎng)引起的早期腎損傷

5.慢性高鹽喂養(yǎng)引起的收縮壓升高取決于腸道微生物群

慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致動脈壓升高，并且研究人員還檢測到抗生素如何影響這種進展。 如圖6所示，雖然HS處理的小鼠的DBP和平均血壓沒有增加，但是慢性HS喂養(yǎng)后SBP明顯升高。 有趣的是，抗生素治療能夠完全恢復(fù)海拔。 這些數(shù)據(jù)強烈表明慢性HS喂養(yǎng)引起的SBP升高取決于腸道微生物群。

圖6. 抗生素可以恢復(fù)慢性高鹽喂養(yǎng)引起的血壓升高

6.來自慢性高鹽處理的小鼠的腸道微生物群可以獨立地引起腸道泄漏和早期腎損傷

最后，為了進一步證明腸道微生物群是腎損傷發(fā)展的上游因素，進行了糞便微生物群移植實驗。喂食正常飲食（不是高鹽）的兩組小鼠口服來自對照和HS處理的小鼠的糞便。8周后，接受對照糞便的對照小鼠的盲腸壁Firmicutes/Bacteroidetes比例（其是微生物群組成改變的主要標(biāo)志）顯著高于接受HS糞便的HS小鼠，其為 與研究人員之前的數(shù)據(jù)一致，表明HS喂養(yǎng)降低了盲腸中的Firmicutes / Bacteroidetes比例，并證明該糞便微生物群移植實驗是成功的（圖7a）。此外，如圖7b和c所示，給藥后4周，由糞便白蛋白含量監(jiān)測的腸道通透性在接受HS喂養(yǎng)糞便的小鼠中顯著增加，并且重要的是，尿白蛋白/肌酸酐比率（目前研究中觀察到的腎功能障礙的主要表型）在移植后4周接受HS喂養(yǎng)的糞便的小鼠中也顯著增加。最后，與對照小鼠相比，HS糞便移植小鼠中腎臟凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（圖7d和e）。這些數(shù)據(jù)進一步表明，HS喂養(yǎng)引起的腸道生態(tài)失調(diào)是腎損傷和功能障礙的原始誘因。

圖7. 腸道泄漏和腎損傷可通過腸道微生物群轉(zhuǎn)移

創(chuàng)新點

研究人員發(fā)現(xiàn)，暴露于飲食鹽的第一個器官是腸道，基于這一理論研究人員巧妙的研究鹽攝取是否能夠直接破壞腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，反過來引發(fā)早期腎臟損傷。研究結(jié)果顯示，8周的慢性HS喂養(yǎng)導(dǎo)致腎凋亡細(xì)胞數(shù)量增加和腎功能損傷增加，這種早期腎損害歸因于腸細(xì)菌易位至腎中。由于HS誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致腸道屏障喪失，發(fā)生易位。該發(fā)現(xiàn)為“腸 – 腎axis”提供了新的見解。目前，沒有證據(jù)表明病原體相關(guān)的分子模式來源于腸可以直接損傷腎臟。因此，該研究是對“腸 – 腎軸”理論的新增加，揭示了HS相關(guān)早期腎損傷發(fā)展的新型基礎(chǔ)發(fā)病機制

參考文獻

Hu J, Luo H, Wang J, et al. Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice.[J]. Experimental & Molecular Medicine, 2017, 49(8):e370.

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根據(jù)百邁客研發(fā)團隊最新公布的項目實測數(shù)據(jù)可以看出，12個水稻有參轉(zhuǎn)錄組共81.1G數(shù)據(jù)量，在專業(yè)版賬號中最快可以12小時58分交付結(jié)果， 根據(jù)樣本特異性和數(shù)據(jù)量的差異性結(jié)果交付時間會有不同。

表1. 有參轉(zhuǎn)錄組各賬號運行參數(shù)

（注：以上生產(chǎn)賬號均指百邁客內(nèi)部信息生產(chǎn)人員所用賬號，處理的均為實際項目）

無參轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)表明，12個玉米樣本共76.9G，專業(yè)版賬號中最快可以在2天5小時完成交付。而在生產(chǎn)賬號中，山雀（36G）和蚱蜢（62G）最快可在1天16小時完成分析。

表2. 無參轉(zhuǎn)錄組各賬號運行參數(shù)

sRNA分析數(shù)據(jù)表明，水稻12個樣本，共9.59G，在專業(yè)版賬號中最快可以6小時29分完成分析。另外，在客戶專業(yè)版賬號中，6個黃瓜樣本，共3.8G數(shù)據(jù)，最快4小時完成分析任務(wù)。

表3. sRNA各賬號運行參數(shù)

由上可見，百邁客云分析已到一個很快的交付速度，無論是對次賬號/年賬號的客戶，還是對走傳統(tǒng)線下項目分析的客戶。對所有轉(zhuǎn)錄調(diào)控項目的（現(xiàn)階段是有參、無參、miRNA）客戶，百邁客已實現(xiàn)生產(chǎn)上云，即線下項目也通過云來投遞任務(wù)！后續(xù)還將擴展到更多的產(chǎn)品！

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百邁客云年賬號：分標(biāo)準(zhǔn)版（8核32G內(nèi)存）、專業(yè)版（8核32G內(nèi)存*4+16核96G內(nèi)存）和豪華版（8核32G內(nèi)存*8+16核256G內(nèi)存）三種，專業(yè)版賬號可使用4款A(yù)PP和100多款小工具，APP可覆蓋轉(zhuǎn)錄調(diào)控、個體重測序、微生物多樣性等。

（注：以上APP均指包含標(biāo)準(zhǔn)分析和個性化分析的集成化分析流程，圖形化界面操作。次賬號所用計算資源最低為年賬號的專業(yè)版計算資源）

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活動日期：2018年4月9日-2018年5月31日

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中文名：水稻信息網(wǎng)（RIGW）：一個全面的秈稻基因組生物信息學(xué)平臺

發(fā)表雜志：MOLECULAR PLANT

影響因子：8.827

Oryza sativa subsp.秈稻和O. sativa subsp. 粳稻是亞洲栽培稻的兩個亞種，其中秈稻的種植面積更廣，遺傳多樣性也更高。在過去的幾年，水稻注釋項目數(shù)據(jù)庫（RAP-DB）（Ohyanagi等，2006）和密歇根州立大學(xué)水稻基因組注釋項目（MSU-RGAP）（Ouyang等，2007）是兩個受歡迎的數(shù)據(jù)庫， 基于粳稻品種Nipponbare（國際水稻基因組測序項目，2005）的統(tǒng)一參考基因組的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。北京基因組研究所的水稻信息系統(tǒng)（BGI-RIS）（Zhao等，2004）是秈稻栽培品種93-11的可用資源，但由于缺乏高質(zhì)量的秈稻參考基因組，其應(yīng)用受到限制。 為了彌補這一缺點，研究人員構(gòu)建了一個綜合全面的平臺：Rice Information GateWay（RIGW，http://rice.hzau.edu.cn/），提供基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì) – 蛋白質(zhì)相互作用（PPIs），代謝網(wǎng)絡(luò)，代謝物和計算工具，以最新的秈稻珍山97（ZS97）和明恢63（MH63）（Zhang et al.，2016）為參考基因組。RIGW通過直觀的Web的界面，為水稻研究提供豐富的基因組學(xué)和其他組學(xué)數(shù)據(jù)。
RIGW在Linux操作系統(tǒng)和Apache Tomcat Web服務(wù)器（http://tomcat.apache.org/）中實現(xiàn)。 所有的基因組數(shù)據(jù)，注釋，同系物，基因表達，PPIs，代謝物和文獻存儲在MySQL數(shù)據(jù)庫（http://www.mysql.com/）中。 圖1A顯示了RIGW中的體系結(jié)構(gòu)，一些有代表性的資源和計算工具。

圖A RIGW體系結(jié)構(gòu)

RIGW上部署GBrowse（https://github.com/GMOD/GBrowse）用于ZS97和MH63基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可視化（圖1B），分別選擇了包括基因注釋和標(biāo)記葉子、圓錐花序以及芽中的RNA-sequencing。

圖B GBrowse

另外，為ZS97，MH63和Nipponbare基因組之間的比較分析提供了Gbrowse_synteny工具（圖1C），所有位于同一染色體區(qū)域的相應(yīng)注釋可以很容易的并行顯示出來（每個基因組都可以設(shè)置為參考）。

圖C Gbrowse_synteny工具

研究人員開發(fā)了一個靈活的查詢界面來高效地檢索和圖形化顯示各種數(shù)據(jù)。 例如，提供關(guān)鍵詞的搜索引擎，用戶輸入關(guān)鍵詞（例如基因位點，基因功能）就可以鏈接到詳細(xì)頁面（例如基因位置，基因結(jié)構(gòu)，可變剪接，其他品種水稻中的同源物， 核苷酸和氨基酸序列，基因表達水平等）。 此外， Gene Ontology（Harris等，2004），InterPro域信息，預(yù)測亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì) – 蛋白質(zhì)相互作用以及外部數(shù)據(jù)庫鏈接在可以獲得的情況下都列在搜索結(jié)果中（圖1D）。 提供局部序列比對搜索工具（BLAST）作為堿基序列的搜索引擎，可以查找在秈稻ZS97，MH63，93-11和粳稻日本晴中的同源序列，比對結(jié)果通過圖形和文本的格式呈現(xiàn)。

圖D 搜索結(jié)果展示

在補充表1和RIGW主頁中列出了ZS97和MH63基因組特征。研究人員根據(jù)相關(guān)文獻，在不同品種水稻中手動收集了2000多個克隆的基因，和2500多個具有詳細(xì)注釋信息的水稻代謝物。利用CREP（http://crep.ncpgr.cn/）的數(shù)據(jù)，研究人員建立了一個友好的網(wǎng)絡(luò)界面，用于查詢和顯示ZS97，MH63及其雜種汕優(yōu)63（SY63）生命周期中39個組織的基因表達水平。對于給定的基因，可獲得的所有組織表達量信息，這極大地促進了其表達模式的研究。由于全基因組PPI網(wǎng)絡(luò)對研究整體細(xì)胞反應(yīng)非常有用，研究人員從公共數(shù)據(jù)庫收集了1,871,563個非冗余水稻PPIs（其中929個為實驗確定的PPIs），包括PRIN（Gu et al.，2011）， RiceNet（Lee等，2015）以及RIGW中的相關(guān)文獻。用戶可以在PPI搜索頁面上提交一個或多個ZS97 / MH63 / Nipponbare的基因ID，查詢相互作用的蛋白質(zhì)，可以幫助揭示不同種類不同功能蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。查詢蛋白及其互作用Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）可視化軟件，不同顏色的點表示不同途徑分類（圖1E）。此外，所有日本晴，ZS97和MH63的PPIs都可以從“下載”模塊下載。

圖E Cytoscape可視化顯示蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

KEGG代謝通路圖是表示代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)信息的圖表，每張圖都匯總了已發(fā)表文獻中的實驗結(jié)果（Kanehisa等，2012）。 基于KEGG Orthology（KO）組，研究人員獲得了ZS97和MH63基因組中的KEGG同源序列，以及它們的代謝途徑。 ZS97和MH63的代謝通路包括四個類別（代謝，遺傳信息處理，環(huán)境信息處理和細(xì)胞過程），每個類別包含許多途徑。 當(dāng)選擇特定的途徑時，在ZS97和MH63中KEGG同源序列的酶/蛋白質(zhì)用綠色標(biāo)出（圖1F）。

圖F KEGG代謝通路圖

在RIGW中集成了一系列計算工具，用于比較水稻和其他植物的進化、功能分析。 OrthoMCL（Li等人，2003）被用于鑒定植物基因組中的同源物，包括擬南芥，短柄草，玉米，葡萄和高粱。研究人員可以通過OrthoMCL（e值：1e-5）來鑒定假定的同源序列和相應(yīng)的邏輯關(guān)系，并獲得水稻和上述植物中產(chǎn)生緊密相關(guān)蛋白質(zhì)的不連續(xù)簇，共鑒定了48,515個假定的直系同源組，并保存在RIGW中，可以從“下載”模塊獲得。研究人員通過MCscanX（Wang et al.，2012）確定了在染色體中的同源基因?qū)Γ╡值<1e-10），以及同源基因座以顯示ZS97和MH63基因組中的部分復(fù)制區(qū)域（圖1G）。研究人員還提供了基因ID轉(zhuǎn)換工具來轉(zhuǎn)換ZS97，MH63，93-11和日本晴之間的直系同源基因ID。此外，該平臺還提供KEGG / GO富集，GO分類工具，可進行功能富集分析。

圖G ?OrthoMCL植物基因組中的同源物鑒定

為了方便不同水稻品種的基因編輯，研究人員整合了CRISPR-P 2.0（Liu et al.，2017）用于設(shè)計各種規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（CRISPR）—Cas系統(tǒng)的指導(dǎo)性RNA序列，實驗結(jié)果如圖1H所示。

圖H CRISPR-P 2.0基因編輯工具

最后，RIGW還提供了一個文本挖掘工具，用戶可通過基因名稱或關(guān)鍵詞搜索獲得的27,831個水稻相關(guān)文獻，文獻來源于PubMed（圖1I）。

圖I 文本挖掘工具

總而言之，研究人員建立了一個全面的生物信息學(xué)平臺RIGW，提供可在GBrowse視圖下查看的ZS97和MH63基因組以及其他組學(xué)數(shù)據(jù)。 RIGW還提供了秈稻，粳稻和其他植物的同源染色體。 并且為用戶提供了友好的網(wǎng)頁界面來顯示水稻中預(yù)測的PPIs，ZS97 / MH63的代謝途徑，CRISPR-Cas單引導(dǎo)RNA設(shè)計工具，和GO富集。 此外，所有的基因組序列和注釋都可以自由訪問，同時，還提供與其他公共數(shù)據(jù)庫的有效鏈接。研究人員即將整合更多的可用資源，并通過新的工具擴展其功能，使RIGW成為一個綜合的生物信息學(xué)平臺，為水稻研究人員服務(wù)。 RIGW免費使用網(wǎng)址是http://rice.hzau.edu.cn/。

百邁客數(shù)據(jù)庫搭建業(yè)務(wù)

構(gòu)樹數(shù)據(jù)庫（papyrifera.biocloud.net）

大豆數(shù)據(jù)庫（soybean-resources.cn）

草業(yè)數(shù)據(jù)庫（grassgene.biocloud.net）

參考文獻：
Song J.-M., Lei Y., Shu C.-C., Ding Y., Xing F., Liu H., Wang J., Xie W.,Zhang J., and Chen L.-L. (2017). Rice Information GateWay (RIGW): A Comprehensive Bioinformatics Platform for Indica Rice Genomes. Mol. Plant. doi: 10.1016/j.molp.2017.10.003.

轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部 賴娟娟 | 文案
吳戈宇 | 審核
圖片來自網(wǎng)絡(luò)，侵刪

影響因子：2.646

摘要

荔枝（Litchi chinensis?Sonn.）是一種重要的水果作物，起源于中國，并在世界熱帶和亞熱帶地區(qū)商業(yè)化種植。荔枝紅色果皮的顏色是荔枝果實市場接受度的重要品質(zhì)，果皮的粉紅色/紅色是花青素生物合成和積累的結(jié)果，花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-蕓香糖苷是荔枝紅果皮中的主要花青素。荔枝花青素的數(shù)量和組成在不同的品種間差異很大，也很大程度上受各種環(huán)境因素的影響。因此，深入了解荔枝中花青素生物合成的調(diào)控具有重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟意義。

許多研究表明，花青素生物合成很大程度上受植物激素的影響。外源脫落酸（ABA）處理促進荔枝花青素生物合成，而外源性N-（2-氯吡啶-4-基）-N’-苯基脲（CPPU）抑制荔枝花青素生物合成。但是，ABA或CPPU調(diào)控花青素生物合成的機制仍不清楚。為了進一步了解外源ABA和CPPU調(diào)控荔枝果實花青素生物合成的分子基礎(chǔ)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院趙杰堂老師課題組對ABA或CPPU處理的荔枝果皮進行轉(zhuǎn)錄組測序，并進行了全面的分析。

材料和方法

選取生長十五年的L. chinensis?cv，妃子笑。 三種處理方式：ABA處理，CPPU處理和對照處理（自來水），每組處理約15個果實簇。處理后分別取0,10和20天果皮圓盤，共取7組樣本分別是：Cont-0，Cont-10，Cont-20，ABA-10，ABA-20，CPPU-10，CPPU-20，分別提取總RNA，用于RNA測序。

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司Illumina Hiseq平臺?150PE

分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud）

分析內(nèi)容：1.原始數(shù)據(jù)質(zhì)控；2.參考基因組比對（未發(fā)表）；3.差異表達基因分析（韋恩圖繪制，KEGG富集分析）；4.基因功能注釋（使用Blast2Go 基于Nr，Nt，COG，KO，GO數(shù)據(jù)庫的最高相似性進行基因注釋）；5.統(tǒng)計分析

花青素和葉綠素含量的測定以及內(nèi)源ABA分析

研究人員根據(jù)Wrolstad（1982）等人的描述進行相應(yīng)的修改對果皮中總花青素含量進行定量，根據(jù)Arnon（1949）描述的方法計算總?cè)~綠素含量，根據(jù)Jia（2011）等人所述，進行了一些修改，使用氣相色譜 – 質(zhì)譜（GC-MS）測定ABA含量，每個過程重復(fù)三次。

結(jié)果

1.經(jīng)外源ABA和CPPU處理后，荔枝果皮的表型、色素含量和內(nèi)源ABA水平的變化

處理10天后，ABA處理和對照處理的果實開始著色（圖1a），盡管花青素含量沒有顯著差異（圖1b）。然而，CPPU處理的果實只有一點點紅色（圖1a），并且花青素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ABA處理和對照的果實（圖1b）。處理后20天，ABA處理的果實變成均勻的紅色，并且CPPU處理的果實仍然是綠色的，帶有一點紅色（圖1a）。同時，對照果實呈現(xiàn)不均勻的紅色（圖1a），這是cv妃子笑的典型特征。如圖1b所示，ABA處理20天后明顯促進荔枝果皮花青素積累，而CPPU處理顯著抑制荔枝果皮花青素積累。與花青素含量變化相反，果實成熟過程中葉綠素含量降低。顯然，ABA處理加速葉綠素降解和CPPU處理延緩了這一過程（圖1c）。ABA處理的果實與對照之間的內(nèi)源ABA水平?jīng)]有顯著差異，而CPPU處理的果相比而言具有較低的ABA水平（圖1d）。

圖1.各處理組果皮顏色、花青素、葉綠素及ABA含量變化

2.RNA測序以及參考基因組比對

共構(gòu)建7個文庫，測序過濾后每個樣本數(shù)據(jù)均不低于6.6Gb，平均GC含量為45.36％（表1）。與荔枝參考基因組比對（未發(fā)表），比對率是74.7％（表1）。

表1. RNA-Seq結(jié)果展示

3.外源ABA和CPPU處理后荔枝果皮基因表達譜的綜合分析

三種處理后0天，10天和20天的荔枝果皮中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達轉(zhuǎn)錄本（圖2）。荔枝果皮色素沉著過程中，在對照組鑒定了2263個差異表達基因（DEGs）（圖2a）。除此之外， 經(jīng)過ABA（圖2b）和CPPU（圖2c）處理后的三個階段分別鑒定了1986和2862個DEGs。

圖2.三組處理中差異表達基因韋恩圖

為了鑒定ABA和CPPU調(diào)控的花青素生物合成的DEGs，分別選擇ABA / CPPU處理后10天和20天的DEGs與對照組進行比較。 與對照相比，在ABA和CPPU處理的果皮中分別有579和827個DEGs。 表達模式分析表明，在ABA處理10天和20天后，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量均比下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量多。而 CPPU處理后20天上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量比ABA處理的低很多。

4.外源ABA處理后的荔枝果皮表達分析

外源ABA處理組，對顯著差異表達的基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞過程，代謝過程，細(xì)胞，細(xì)胞部分，催化活性和轉(zhuǎn)運蛋白活性有關(guān)的GO terms的富集。也做了DEGs的KEGG通路富集分析。 579個DEGs中的351個被富集到101個通路中，前5個通路組分別為：植物 – 病原體相互作用通路（49DEGs），植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（32DEGs），類黃酮生物合成（27DEGs），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（27DEGs） 碳代謝（20 DEGs），淀粉和蔗糖代謝（20 DEGs）。

外源ABA處理的DEGs中，大部分與花青素合成有關(guān)的DEGs上調(diào)，如PAL，C4H，CHS，CHI，DFR，LDOX和GTs。此外， FLS和LAR等黃酮醇和原花青素合成基因上調(diào)， C3’H，COMT，F(xiàn)5H，CCR，CAD等木質(zhì)素合成基因也上調(diào)了。 ABA處理后另一類顯著差異表達的unigene參與植物激素代謝和信號傳導(dǎo)。兩個編碼ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶的NCEDs unigenes顯著上調(diào)，而ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在外源ABA處理后沒有明顯的變化。外源ABA處理也影響了與生長素信號途徑有關(guān)的基因表達。例如，屬于Aux / IAAs家族的兩個unigenes上調(diào)。另外，編碼DELLA蛋白，負(fù)調(diào)控GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的unigenes經(jīng)ABA處理后上調(diào)。

5.外源CPPU處理的荔枝果皮表達分析

將CPPU處理組與對照組之間的DEG進行GO分析。 與外源ABA處理相比，差異不顯著。KEGG富集分析， 897個DEGs中的493DEGs個被富集到117個通路，前六個通路組是碳代謝（54DEGs），植物 – 病原體相互作用（49DEGs），光合作用（42DEGs），氨基酸生物合成（38DEGs），苯丙素生物合成 （33DEGs），植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（32DEGs）。

與ABA處理不同的是，外源CPPU處理后許多上調(diào)基因參與碳代謝，氨基酸生物合成和光合作用的基因，特別是在CPPU處理后10天較明顯。例如，unigene Litchi__GLEAN_10019646在外源CPPU處理10天后顯著上調(diào)6.1倍，它編碼捕光復(fù)合體II葉綠素a / b結(jié)合蛋白1。另外一類在外源性CPPU處理中顯著差異表達的unigenes涉及葉綠素生物合成代謝。 CPPU處理后，大部分參與類黃酮和花青素生物合成的DEGs均下調(diào)，如PAL，C4H，CHS和LDOX。此外，黃酮醇和原花青素合成基因，如FLS和LAR也下調(diào)。有29個DEGs比對到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中，ABA信號中的兩個ABA受體PYR / PYL均被CPPU下調(diào)。另外，與生長素，GA和乙烯信號有關(guān)的基因大部分也下調(diào)。

6.ABA和CPPU處理的荔枝果皮的表達分析

受外源ABA和CPPU共同響應(yīng)的DEGs共199個，其中大部分unigenes在兩種處理組中顯示出類似的改變。 值得注意的是，有10個unigenes在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出相反的模式。 其中，編碼GST4蛋白的unigene（Litchi_GLEAN_10051861）被報道與荔枝中花青素的液泡轉(zhuǎn)移有關(guān)。

ABA處理和CPPU處理之間的顯著差異之一是葉綠素代謝。 鑒定了與葉綠素生物合成和降解有關(guān)的24個候選基因，其響應(yīng)外源ABA和CPPU的表達模式如圖3所示?？傮w而言，ABA處理對葉綠素生物合成和降解的基因表達沒有顯著影響。 與對照相比，CPPU處理顯著提高大多數(shù)葉綠素合成基因，并下調(diào)TF SGR。

圖3.兩種處理后荔枝果皮中葉綠素生物合成和降解相關(guān)差異表達基因熱圖

經(jīng)外源ABA處理和CPPU處理的一些涉及類黃酮生物合成途徑的unigenes的表達有不同的改變（圖4）。 該研究鑒定了不止一個荔枝黃酮類生物合成的結(jié)構(gòu)基因，并且不同的基因家族成員表現(xiàn)出不同的表達模式。 根據(jù)研究人員以前的研究，選擇黃酮生物合成相關(guān)基因作進一步分析。 如圖4所示，ABA處理上調(diào)荔枝黃酮合成的結(jié)構(gòu)基因，而CPPU抑制其表達，特別是PAL，CHS和F3’H。

圖4.兩種處理后荔枝果皮中黃酮類生物合成途徑相關(guān)差異表達基因概覽

7.qRT-PCR驗證

對9個顯著差異表達的基因進行qRT-PCR實驗，分別是：HEMA，CBR，DFR，CHI，UFG，chloaophyllase，RCCR和SGR。 結(jié)果顯示，RT-PCR結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致（圖5）。

圖5. qRT-PCR分析結(jié)果圖

結(jié)論

在褪色階段外源ABA處理提高了荔枝的顏色，而外源CPPU處理抑制了花青素的積累。 RNA-seq分析結(jié)果顯示：兩種處理組（ABA和CPPU）與對照相比，分別有579個和827個差異表達基因。外源ABA處理中，上調(diào)表達的有類黃酮和花青素合成相關(guān)基因。相反，外源CPPU處理中，誘導(dǎo)了與碳代謝，氨基酸生物合成和光合作用有關(guān)的基因，并下調(diào)了花青素生物合成相關(guān)基因。結(jié)果表明，ABA處理對花青素生物合成和糖代謝中涉及的基因的表達有顯著作用。 另外，ABA處理對葉綠素分解代謝相關(guān)基因無顯著影，CPPU處理顯著增加了葉綠素合成基因的表達，并抑制了葉綠素降解基因（SGR）的表達，說明外源CPPU處理通過增加葉綠素合成基因的表達和抑制葉綠素降解基因的表達來影響葉綠素分解代謝。進一步分析顯示，ABA和CPPU處理也影響其他植物激素信號傳導(dǎo)途徑（如生長素，GA和乙烯）中的基因表達，說明ABA和CPPU可能與其他激素信號途徑如生長素，GA和乙烯相互作用，形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控花青素的生物合成。

創(chuàng)新點

研究人員在前期的研究中為此項研究做了較好的鋪墊，然而，早期的研究僅關(guān)注于外源ABA和CPPU對荔枝果皮單基因或少量基因的表達。本研究采用轉(zhuǎn)錄組分析方法，了解外源ABA和CPPU處理后荔枝果皮的整體分子變化。本研究為ABA和細(xì)胞分裂素影響荔枝和其他富含花青素的果樹中花青素生物合成的機制探索提供了有價值的信息。

參考文獻：Hu, B., Li, J., Wang, D. et al. Plant Growth Regul (2017). https://doi.org/10.1007/s10725-017-0351-7

云平臺助力蕪菁花芽轉(zhuǎn)錄組比較分析解析多倍體異常減數(shù)分裂過程

雜志：?Frontiers?in?Plant?Science?

影響因子：4.298

PMID:28553302

云平臺助力鄭州大學(xué)的老師們發(fā)表了一篇關(guān)于四倍體與二倍體蕪菁轉(zhuǎn)錄組比較分析的文章，這是第一個同時在細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄組水平證明染色體多倍性對減數(shù)分裂過程有不利影響的研究，有助于全面了解二倍體和多倍體蕪菁減數(shù)分裂時花芽轉(zhuǎn)錄組的一致性和差異性。

研究背景：

多倍體化對于動植物進化及物種形成具有重要意義。染色體倍性增加在大多數(shù)植物中十分常見，約30-80％的被子植物在進化過程中歷經(jīng)這一過程，種內(nèi)基因組復(fù)制可產(chǎn)生同源多倍體，種間雜交可產(chǎn)生異源多倍體。理解多倍體對植物繁殖的影響對于多倍體育種項目具有重要意義。

本文在細(xì)胞和分子水平對同源四倍體、二倍體蕪菁的生殖組織（未成熟的花芽）進行了轉(zhuǎn)錄組比較分析。先進行細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯著異常后，進行RNA測序分析，進一步闡明這種細(xì)胞學(xué)差異的分子機制。

材料和方法:

材料：溫室中培育蕪菁同源四倍體和二倍體，采集1-1.5mm的花芽。

細(xì)胞學(xué)分析：花芽制片觀察染色體行為。

轉(zhuǎn)錄組分析：二倍體花芽樣本T1，T2，T3,同源四倍體樣本T4，T5，T6進行測序，篩選DEGs，進行功能注釋及相關(guān)驗證。

測序平臺：Illumina?HiSeq?2000

分析平臺：BMKCloud，具體分析如下：

測序原始數(shù)據(jù)去接頭、低質(zhì)量序列后與參考基因組比對（TopHat2），對比對上的序列進行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)，評估表達水平（Cufflinks）。鑒定DEGs（logFC≥2，F(xiàn)DR<0.01）并與Nr、UniProtKB\Swissprot、KOG、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。

研究結(jié)果：

1.同源四倍體蕪菁異常的減數(shù)分裂過程

減數(shù)分裂過程中染色體行為分析結(jié)果顯示：二倍體中，同源染色體中期配對為二倍體，后期分離（圖1A-D）。四倍體中，在減數(shù)分裂中期I形成多倍體和單倍體，在后期I、II發(fā)生不均等分離（圖1E-L）。

圖1?四倍體蕪菁異常染色體行為

統(tǒng)計結(jié)果表明與二倍體相比，蕪菁多倍體化后整個減數(shù)分裂過程發(fā)生了不規(guī)則變化。

圖2?四倍體蕪菁減數(shù)分裂中異常染色體行為分析

2.測序結(jié)果

每個樣本文庫得到29.07?GB?clean?read，Q30≥88.55%?。同源四倍體、二倍體比對到參考基因組效率分別為74.34%，75.88%。樣本組的表達模式分析共得到40927個基因，其中有1001個新基因。

3.DEGs分析

40927個基因中，4601個基因是差異表達的（圖3A），2343個上調(diào)，2259個下調(diào)（圖3B），兩組間DEGs占比較少（(11.24%）。隨機挑選DEGs進行層次聚類，分析表達模式（圖3C），發(fā)現(xiàn)四倍體中K1、K3、K6、K9類別下調(diào)，K2、K4、K5、K7，K8類別顯著上調(diào)。

圖3?DEGs表達分析

與COG、GO、KOG、Nr、KEGG、Swiss-Prot比對后，97%的DEGs至少能與一個數(shù)據(jù)庫比對上（表1）

表1?差異表達Unigene注釋

COG分類中，2615個DEGs可歸到25個COG類別（圖4），其中包含最多DEGs的類別為：復(fù)制重組與修復(fù)（222個,8.49%），轉(zhuǎn)錄（261個,9.98%），一般功能（515個,19.69%)，與KEGG結(jié)果一致。

GO分類中大多數(shù)DEGs聚類到細(xì)胞過程（61.97％），繁殖過程（15.49％），結(jié)合過程（42.96％）（圖5）。

KEGG功能注釋結(jié)果表明，4,601個DEGs中有1,453個可歸到50個生物途徑。高度富集的通路為：氨基酸合成（48個，3.3％），植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（61個，4.2％）和蛋白質(zhì)加工內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑（47個，3.2％）（圖6）。

圖4?COG分類

圖5?新DEGs的GO分類

圖6?KEGG富集通路

4.減數(shù)分裂相關(guān)DEGs分析

為闡述四倍體蕪菁減數(shù)分裂過程改變相關(guān)的遺傳信息，選擇以下明顯與減數(shù)分裂相關(guān)的COG類別進行細(xì)分：（1）復(fù)制，重組和修復(fù);（2）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué);（3）細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分區(qū);（4）細(xì)胞骨架。在4,601個位點中，共鑒定出288個與減數(shù)分裂相關(guān)的基因（圖7A）。
應(yīng)用擬南芥數(shù)據(jù)庫（TAIR）的BLASTN搜索，進一步鑒定蕪菁中減數(shù)分裂直系同源基因，11個兩組間差異表達的已知減數(shù)分裂基因。如圖7所示，顯著富集的L組（復(fù)制，重組和修復(fù)）包含121個上調(diào)、102個下調(diào)基因，這組聚類結(jié)果（圖8B）顯示已知減數(shù)分裂基因（包括RAD54，DMC1和RPA）在四倍體蕪菁中表達顯著下調(diào)。D組（細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂和染色體分配）中，10個下調(diào)，13個上調(diào)，已知的減數(shù)分裂基因DIF1/SYN1和CyclinA1-2/TAM上調(diào)（圖7C）。在B組（染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化）（圖7D），有7個基因上調(diào)，包括已知調(diào)節(jié)開花時間和植物發(fā)育的NF-YB8基因，14個基因下調(diào)，包括組蛋白相關(guān)基因（H2AV和H4）。Z組（細(xì)胞骨架）中，8個基因上調(diào)，7個基因下調(diào)（圖7E），且沒有已知減數(shù)分裂相關(guān)基因。已知減數(shù)分裂基因MMD1和HOP2在一般功能組（R）中富集（圖4）。HOP2，XRI1，ZYP1a和ZYP1b未歸到任何COG組。

KEGG比對后將288個中的108個DEGs分配到28個途徑，包括減數(shù)分裂相關(guān)同源重組（2.8％），DNA修復(fù)和重組（6.5％），DNA復(fù)制（3.7％），染色體和相關(guān)蛋白（4.6％）。

圖7?COG分類中減數(shù)分裂相關(guān)基因分布及表達分析

同源重組對于真核生物減數(shù)分裂中SPO11蛋白質(zhì)引起的DSBs的精確修復(fù)十分重要，作為調(diào)節(jié)關(guān)鍵介質(zhì)的DMC1，RAD54和RPA在這個途徑中顯著下調(diào)。Cyclin-A1-2?/?TAM是DNA復(fù)制途徑中唯一與細(xì)胞周期蛋白有關(guān)的基因，表達上調(diào)。這些結(jié)果表明染色體集在同源四倍體中增加了一倍，與減數(shù)分裂有關(guān)的大多數(shù)基因可能通過上調(diào)或至少正常表達以滿足減數(shù)分裂期間基因組含量增加的需求。否則，減數(shù)分裂關(guān)鍵基因下調(diào)可能會干擾四倍體減數(shù)分裂中染色體行為。

qRT-PCR?對24個減數(shù)分裂相關(guān)基因進行驗證，20多個基因表達與測序結(jié)果一致。對擬南芥中直系同源基因分析結(jié)果顯示兩個物種減數(shù)分裂相關(guān)基因的總體表達模式相近。

結(jié)果：

本研究細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，合成多倍體整體減數(shù)分裂過程是顯著不規(guī)則的。為從分子水平闡明這一過程的遺傳基礎(chǔ)，本文進行了同源四倍體和二倍體蕪菁花芽間的遺傳調(diào)節(jié)差異的轉(zhuǎn)錄組比較分析。在40927個表達基因中，同源四倍體蕪菁花芽中鑒定出4601個DEGs，其中288個與減數(shù)分裂相關(guān)。DMC1（已知減數(shù)分裂特異性基因，與DSBs同源染色體依賴性修復(fù)相關(guān)）在同源四倍體蕪菁中表達顯著下調(diào)，可能與減數(shù)分裂I期的異常有關(guān)。某些RNA解旋酶，細(xì)胞周期、體細(xì)胞DNA修復(fù)相關(guān)的DEG在基因組復(fù)制后表達上調(diào)，減數(shù)分裂DSB修復(fù)有關(guān)基因表達顯著下調(diào)。蕪菁和擬南芥中減數(shù)分裂相關(guān)基因的總體表達模式相近。

創(chuàng)新點：

這是第一個在細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄組水平證明染色體多倍性對減數(shù)分裂過程有不利影響的研究，有助于全面了解二倍體和多倍體蕪菁減數(shù)分裂時花芽轉(zhuǎn)錄組的一致性和差異性。

參考文獻：Braynen?J,?Yang?Y,?Wei?F,?et?al.?Transcriptome?Analysis?of?Floral?Buds?Deciphered?an?Irregular?Course?of?Meiosis?in?Polyploid?Brassica?rapa[J].?Frontiers?in?Plant?Science,?2017,?8:768.

不同肌內(nèi)脂肪含量的兩種牛中肝臟轉(zhuǎn)錄組研究

發(fā)表雜志：Biochemical?and?Biophysical?Research?Communications

影響因子：2.466

PMID：28669724

摘要

肌內(nèi)脂肪（IMF）含量是牛肉質(zhì)量的重要決定因素。晉南牛和西門塔爾牛之間的IMF含量有顯著差異。在這里，為了鑒定與IMF沉積有關(guān)的候選基因和網(wǎng)絡(luò)，研究人員深入探索了這兩種牛中肝臟的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)。研究人員對5個晉南牛和3個西門塔爾牛的肝臟進行轉(zhuǎn)錄組測序，產(chǎn)生了約4139M?reads。共檢測到124個差異表達基因（DEGs），在晉南牛肉中，有53個上調(diào)，71個下調(diào)。?此外，共鑒定了1282個潛在的新基因。GO分析顯示，這些DEGs（包括CYP21A2，PC，ACACB，APOA1和FADS2）在脂質(zhì)生物合成過程、膽固醇酯化調(diào)節(jié)、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運和脂蛋白脂肪酶活性的調(diào)節(jié)中顯著富集。參與丙酮酸代謝途徑的基因也顯著過表達。此外，本研究還確定了一個與脂質(zhì)代謝有關(guān)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，這可能是導(dǎo)致牛在基因組中沉積的原因。由此推論，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的DEGs可能在IMF沉積中起重要作用。綜上所述，研究者提出了一組候選基因和相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以與IMF沉積相關(guān)聯(lián)，并用作牛的育種中的生物標(biāo)志物。

背景

牛肉是人類食物最重要的蛋白質(zhì)來源之一。在不同品種的牛之間，生長速度，肌肉質(zhì)量和肉質(zhì)存在顯著差異。津南黃牛是我國五大黃牛品種之一，以其肉質(zhì)鮮嫩，紋路鮮明而聞名。相比之下，源自瑞士的西門塔爾牛是世界上大量喂養(yǎng)的品種，主要用于生產(chǎn)好的乳品或肉質(zhì)的品種，它們的生長速度較快，瘦肉含量高，以至于肌內(nèi)脂肪（IMF）含量以及嫩度低于晉南牛肉。?IMF含量和肌肉纖維特性是肉品質(zhì)的主要決定因素，包括感官特性（嫩度，多汁性和風(fēng)味）和營養(yǎng)價值。IMF含量與牛肉感官品質(zhì)性狀呈正相關(guān)。西門塔爾牛和晉南牛的IMF含量差異使其成為比較基因組學(xué)研究的重要材料，用來研究牛肌內(nèi)脂肪酸沉積的分子機制。

肝臟與脂肪組織和骨骼肌是哺乳動物脂質(zhì)代謝和其他代謝過程中最重要的器官之一。它是非酯化脂肪酸吸收、氧化和代謝轉(zhuǎn)化的中心器官。此外，它具有從頭脂肪生成，細(xì)胞質(zhì)三酰甘油儲存，從葡萄糖和其他非脂質(zhì)前體合成脂肪酸的酶活性。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已有對豬和乳鴿肝臟進行轉(zhuǎn)錄組研究，以探索影響IMF成分的潛在候選基因。日本黑色longissimus?dorsi和荷斯坦黑白花牛轉(zhuǎn)錄組報告顯示，在日本黑牛中，具有較強IMF沉積能力特征的差異表達基因中，大多數(shù)表達上調(diào)。并且鑒定了一個與細(xì)胞形態(tài)和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)。然而，并沒有兩種不同IMF水平的牛肝臟比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。

在該研究中，使用RNA-Seq方法來分析西門塔爾牛和津南牛的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。這項研究的主要目標(biāo)是確定差異表達的基因和相互作用網(wǎng)絡(luò)，這可能有助于牛的肌內(nèi)脂肪酸組成研究。?另外，該研究鑒定的候選基因可能會對牛的分子育種有幫助。

材料和方法

為了消除性別差異，該研究全部選擇雄性牛。3頭西門塔爾和5頭晉南牛，生長1.5年，屠殺后30分鐘內(nèi)取肝臟組織，在液氮中快速儲存，提取總RNA。

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司Illumina?Hiseq?3000平臺，PE150

分析平臺：百邁客云科技有限公司（BMKCloud）

分析內(nèi)容：1.低質(zhì)量reads質(zhì)控；

2.參考基因組比對（Bos?taurus參考基因組，版本UMD?3.1.1）；

3.基因表達量和差異表達分析；

4.差異表達基因的功能富集分析；

5.蛋白質(zhì)互作分析；

結(jié)果

1.西門塔爾牛和晉南牛肝組織RNA測序結(jié)果

使用Illumina?Hiseq?3000平臺對西門塔爾（n?=?3）和晉南（n?=?5）牛的肝進行轉(zhuǎn)錄組測序。質(zhì)控后共獲得61.33?Gb數(shù)據(jù)，約為?；蚪M的23倍。8個樣本的Q30均大于93％。與參考基因組比對率均在80.27％-85.48％范圍內(nèi)（表1）。

表1.RNA測序數(shù)據(jù)和比對結(jié)果統(tǒng)計

2.新基因的鑒定和注釋

利用Cufflinks軟件來鑒定西門塔爾牛和晉南牛的新基因。該研究中共檢測到1282個潛在的新基因。?其中，有1043個基因通過與數(shù)據(jù)庫（NR，Swiss-Prot，GO，COG，KOG，Pfam和KEGG）比對進行了注釋。?值得關(guān)注的是，在Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以注釋到364個新基因，這意味著它們是潛在的蛋白質(zhì)編碼基因，在之前的牛參考基因組中沒有注釋。?此外，?GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中分別注釋548和371個新基因。

3.差異基因表達分析

使用DESeq?R軟件包鑒定西門塔爾牛與晉南牛的差異表達基因（DEGs）。將Fold?Change≥2且FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定了124個顯著的DEGs，其中晉南牛中有53個（42.7％）上調(diào)，71個（57.3％）下調(diào)（圖2）。西門塔爾牛和晉南牛中17個新基因有顯著差異。一些轉(zhuǎn)錄本在豐度上有很大的差異，如ENSBTAG00000047322（|log2-fold?change|?=?7.16），血紅蛋白亞基beta（HBB，|log2-fold?change|=?3.76）和超氧化物歧化酶1（SOD1，|log2-fold?change?|=?8.38）它們被認(rèn)為與肌內(nèi)脂肪酸組成相關(guān)的候選基因。

圖1.兩種牛中124個差異表達基因熱圖

4.差異表達基因功能富集分析

為了深入了解西門塔爾牛和晉南牛肝中差異表達基因的生物學(xué)關(guān)系，研究人員將差異表達基因進行GO，KEGG富集分析。結(jié)果顯示，?GO生物學(xué)過程中顯著富集了23個terms，主要包括催化活性（GO：0043086），脂質(zhì)生物合成過程（GO：0008610），膽固醇酯化調(diào)節(jié)（GO：0010872），?逆轉(zhuǎn)膽固醇轉(zhuǎn)運（GO：0043691）和脂蛋白脂肪酶活性的調(diào)節(jié)（GO：0051004）的負(fù)調(diào)節(jié)(P?<?0.05）。?共有4個KEGG通路被顯著富集（P?<0.05），主要包括造血細(xì)胞譜系（bta04640），細(xì)胞粘附分子（CAMs，bta04514），丙酮酸代謝（bta00620）和T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)通路（bta04660）（圖2）。

圖2.兩種牛的差異表達基因GO富集中前20個顯著富集的terms和KEGG通路分析

5.蛋白質(zhì)相互作用分析

為了解西門塔爾牛和晉南牛肝臟中DEGs的相互作用，研究人員利用Ingenuity?Pathway?Analysis（IPA）軟件進行了蛋白質(zhì)?–?蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。共鑒定了9個網(wǎng)絡(luò)，?有趣的是，第二個網(wǎng)絡(luò)與脂質(zhì)代謝，分子運輸和小分子生物化學(xué)相關(guān)，該網(wǎng)絡(luò)包括乙酰輔酶A羧化酶β（ACACB），載脂蛋白A1（APOA1），脂肪酸去飽和酶?2（FADS2）和其他脂代謝相關(guān)基因（圖3）。

圖3.兩種牛中差異表達基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

結(jié)論

綜上所述，該研究系統(tǒng)地比較了晉南牛和西門塔爾牛的肝臟轉(zhuǎn)錄組差異。?總共有124個被識別出來。?與這兩個品種的IMF沉積差異一致，這些DEGs在脂質(zhì)生物合成和代謝相關(guān)的生物過程和途徑中富集。?與脂質(zhì)代謝有關(guān)的相互作用網(wǎng)絡(luò)也被確定。?總的來說，該研究提供了與IMF沉積有關(guān)的潛在的候選基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這對于產(chǎn)生更好的肉質(zhì)的牛飼養(yǎng)是有用的。

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創(chuàng)新點

在前期的報告中有較強IMF沉積能力特征的牛轉(zhuǎn)錄組研究，但是并沒有兩種不同IMF水平的牛轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。該研究中，使用RNA-Seq方法來分析兩種不同IMF水平的牛肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。鑒定了差異表達的基因和相互作用網(wǎng)絡(luò)，這一結(jié)果為牛的肌內(nèi)脂肪酸組成研究奠定了基礎(chǔ)。此外，該研究鑒定的候選基因可能會對牛的分子育種有幫助。

參考文獻

Xi?W,?Zhang?Y,?Zhang?X,?et?al.?The?comprehensive?liver?transcriptome?of?two?cattle?breeds?with?different?intramuscular?fat?content[J].?Biochem?Biophys?Res?Commun,?2017:1018-1025.