基于樣品中的物種組成及豐度信息推測樣品中表型類型和功能組成及差異。包含PICRUSt2功能預測、FAPROTAX功能預測、BugBase表型預測、Tax4Fun2功能預測和真菌FunGuild表型預測。
一. PICRUSt2功能預測
PICRUSt1軟件依賴于Greengene數據庫進行物種比對、功能數據輸出。而Greengene數據庫在2013年之后就停止了更新，距今為止已有7年。隨著時間的推移，大量微生物基因組數據測序獲得，而停止更新的Greengene數據庫限制了PICRUSt的功能預測范圍。對于近年來測序獲得微生物功能功能信息無法進行預測，滿足不了當前的研究需求，為了補上這塊滿足科研工作者的需求，PICRUSt團隊于近期升級了軟件，正式公布了PICRUSt2。
1）將待預測的OTU代表序列置于軟件中已有的系統(tǒng)發(fā)育樹中，而不是直接對OTU序列進行分類學注釋；
2）不再基于GreenGene 16S數據庫進行功能預測，其用于預測的參考基因組數據庫相比先前也已擴大了10倍以上
參考文獻：Douglas G M, Maffei V J, Zaneveld J, et al. PICRUSt2: An improved and extensible approach for metagenome inference. bioRxiv, 2019.
功能組成分析：統(tǒng)計各樣品在不同分類層級上的功能組成。
注：橫坐標為樣品名稱；縱坐標為功能相對豐度百分比。
功能差異分析：統(tǒng)計各樣品或者各組在不同分類層級上的功能差異。
注：圖中不同顏色代表不同的樣品或分組。左圖所示為不同功能在兩個樣品或者兩組樣品中的豐度比例，中間所示為95%置信度區(qū)間內功能豐度的差異比例，最右邊的值為校正后p值。
二. FAPROTAX功能預測
FAPROTAX較適用于對環(huán)境樣本的生物地球化學循環(huán)過程（特別是碳、氫、氮、磷、硫等元素循環(huán)）進行功能注釋預測。FAPROTAX是根據已發(fā)表的文獻手動構建的數據庫，它把原核微生物的分類和代謝等功能對應起來，目前收集自4600多個原核微生物的80多個功能分組7600多條功能注釋信息。
參考文獻：Louca S, Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global ocean microbiome[J]. Science, 2016, 353(6305): 1272-1277.
三. BugBase表型預測
BugBase是一種預測復雜微生物組內功能途徑的生物水平覆蓋以及生物可解釋表型的方法。BugBase首先通過預測的16S拷貝數對OTU進行歸一化，然后使用提供的預先計算的文件預測微生物表型。包括以下七方面：革蘭氏陽性 （Gram Positive）、革蘭氏陰性 （Gram Negative）、生物膜形成 （Biofilm Forming）、致病潛力 （Pathogenic Potential）、移動元件含量 （Mobile Element Containing）、氧的利用 （Oxygen Utilizing）、氧化脅迫耐受 （Oxidative Stress Tolerant）。
參考文獻：Ward T, Larson J, Meulemans J, Hillmann B, Lynch J, SidiropoulosD,Spear J, Caporaso G, Blekhman R, Knight R, Fink R, Knights D. 2017.BugBase predicts organism level microbiome phenotypes. bioRxiv.
四. Tax4Fun2功能預測
Tax4Fun全面升級為Tax4Fun2.評估微生物群落的功能和冗余度是環(huán)境微生物學的主要挑戰(zhàn)。Tax4Fun2可基于16S rRNA基因序列快速預測原核生物的功能譜和功能冗余。通過合并用戶定義的、特定于棲息地的基因組信息，可以顯著提高預測功能圖譜的準確性。
優(yōu)點：
（1）不再局限于僅SILVA的特定版本注釋的OTU豐度表，允許直接以OTU代表序列作為輸入，通過與指定參考數據庫的比對實現(xiàn)物種注釋。除了Tax4Fun2提供的已構建好的參考集（相比之前大幅擴大），也允許我們提供自定義的參考集，使用非常靈活。
（2）側重于原核數據，但也可以合并真核數據。
（3）提供了計算特定功能冗余的方法，對于預測特定功能在環(huán)境擾動期間丟失的可能性至關重要。
（4）精度和穩(wěn)定性顯著提升。
參考文獻：Wemheuer F, Taylor J A, Daniel R, et al. Tax4Fun2: a R-based tool for the rapid prediction of habitat-specific functional profiles and functional redundancy based on 16S rRNA gene marker gene sequences. bioRxiv, 2018.
五. FunGuild表型預測
FUNGuild(Fungi Functional Guild)是一種可用于由生態(tài)協(xié)會分類學解析真菌的工具，用簡單而一致的方法將大型序列庫分類為具有生態(tài)意義的類別。根據營養(yǎng)方式將真菌分為12類，然后構建了一個真菌分類和功能分組（guild）之間的數據庫，通過這個數據庫你就可以對真菌進行功能分類。
病理營養(yǎng)型（pathotroph）：通過損害宿主細胞而獲取營養(yǎng)（包括吞噬型真菌phagotrophs）。
共生營養(yǎng)型（symbiotroph）：通過與宿主細胞交換資源來獲取營養(yǎng)。
腐生營養(yǎng)型（saprotroph）：通過降解死亡的宿主細胞來獲取營養(yǎng)。包括動物病原菌（animal pathogens）、叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）、外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi）、杜鵑花類菌根真菌（ericoid mycorrhizal fungi）、葉內生真菌（foliar endophytes）、地衣寄生真菌（lichenicolous fungi）、地衣共生真菌（lichenized fungi）、菌寄生真菌（mycoparasites）、植物病原菌（plantpathogens）、未定義根內生真菌（undefined root endophytes）、未定義腐生真菌（undefined saprotrophs）和木質腐生真菌（wood saprotrophs）。
參考文獻：Nguyen NH, Song Z, Bates ST, Branco, S, Tedersoo L, Menke J, Schilling JS, Kennedy PG. 2016. FUNGuild: an open annotation tool for parsing fungal community datasets by ecological guild. Fungal Ecology 20:241-248.
MicroPITA分析
在做完16S、18S或ITS等微生物多樣性研究后，我們常常還會想進一步了解微生物群落的功能。通常情況下，會采用宏基因組、宏轉錄組或宏代謝組等方法深入分析，但相對于擴增子測序，宏基因組等測序手段的價格還是相對較高，因此需要從已測完的樣本中再挑選合適的樣本進行宏基因組測序?？衫胢icroPITA進行樣品預測，挑選出合適的樣品。該分析是基于大量微生物多樣性的數據，根據不同指標篩選出代表性樣本，以便于開展開展后續(xù)研究。
| 類型 | 方法 | 含義 | 樣本特點 |
| 無監(jiān)督方法 | diverse | 選擇α多樣性最高的樣本 | 生態(tài)多樣性高 |
| features | 根據目標物種挑選樣本 | 針對特定物種 | |
| extreme | 選擇β多樣性距離最遠的樣本 | 極端樣本 | |
| representative | 最能反映整體距離差異的樣本 | 核心樣本 | |
| 有監(jiān)督方法 | Distinct | 根據表型/分組特征，挑選組間β多樣性距離最大的樣本 | 依據表型/分組特征，選擇極端樣本 |
| Discriminant | 根據表型/分組特征，挑選離分組中心最近的樣本 | 依據表型/分組特征，挑選核心樣本 |
參考文獻：Tickle TL, Segata N, Waldron L, Weingart U, Huttenhower C. Two-stage microbial community experimental design. ISME J. 2013 Dec;7(12):2330-9. doi: 10.1038/ismej.2013.139. Epub 2013 Aug 15. PMID: 23949665; PMCID: PMC3834858.
群落結構分析
微生物群落生態(tài)學的一個主要目標是了解構成跨時空物種豐度模式的過程。確定性和隨機性兩種類型的過程會影響群落的聚集。確定性過程與生態(tài)選擇相關，隨機過程包括不可預測的擾動、概率性的散布和隨機的出生-死亡事件等，這些變化不是由環(huán)境決定的適應性結果。通過零模型量化群落的絕對系統(tǒng)發(fā)育距離與隨機系統(tǒng)發(fā)育距離的偏離度，偏離程度越大，群落受確定性因素的影響越大，偏離度越小，群落受隨機性因素的影響越大。通常使用βNTI（最近種間親緣關系指數）以評估不同時空尺度下隨機性和確定性過程對微生物群落組裝的影響。
其中，| βNTI |>2表示觀察到的兩個群落之間的更替主要由選擇控制，其中βNTI>+2與變量選擇一致，而βNTI<-2表示同質選擇。因此，| βNTI |<2意味著一組群落的更替受擴散限制、均勻化擴散或未消除過程的控制。為了理清這些過程，Raup-Crick矩陣（RCbray）基于群落的標準Bray-Curtis矩陣構建，提供有關所觀察到的流動程度是否明顯偏離預期的信息。這個值等于觀測到的Bray-Curtis和零分布之間的偏差，范圍是-1到+1。| RCbray |<0.95可以解釋為終止過程的影響。反過來，擴散限制加上漂移導致大于預期的周轉率（RCbray>+0.95），而RCbray<-0.95則表明群落組成的周轉率主要受均勻擴散控制。
參考文獻：Jizhong, Zhou, Daliang, et al. Stochastic Community Assembly: Does It Matter in Microbial Ecology[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews, 2017.
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大鼠飲食中添加膳食蜂膠可改善葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎并調節(jié)腸道菌群
雜志：?nutrients
影響因子：3.550
PMID:28805735
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得了腸炎怎么辦，多吃點蜂膠吧，是的，你沒有聽錯，蜂膠可是個好東西，
蜂膠味微甘、性平，有潤膚生肌、消炎止痛的功效，對于結腸炎、口腔潰瘍、胃潰瘍等有一定的輔助療效。今年中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所的王凱老師在nutrients 發(fā)表了一篇關于楊樹來源蜂膠改善結腸炎癥狀的文章，證明膳食添加0.3％濃度蜂膠添加能顯著改善大鼠結腸炎癥狀并改變腸道菌群多樣性。可以作為一種新的IBD治療輔助手段呢。
研究背景：
炎性腸病(IBD)是一種胃腸慢性炎癥疾病。包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結腸炎（UC）。IBD確切病因還不確定，但誘因可能為遺傳易感性、腸道菌群失調、環(huán)境因素，飲食和生活方式等因素。近年來隨著飲食習慣的西式化轉變，發(fā)展中國家IBD發(fā)病率迅速增加。食療對腸道菌群代謝和多樣性的影響較大，是一種IBD的干預手段。
富含多酚的食物對人體健康有益，多酚具強抗氧化性，可清除自由基，也可調節(jié)細胞氧化還原信號傳導途徑，可通過抑制多種炎癥介質產生和釋放發(fā)揮抗炎作用。蜂膠是一種重要的對健康有益的樹脂物質，含豐富的多酚類化合物。蜂膠提取物可能通過調節(jié)關鍵炎癥介質的產生及阻斷NF-κB的激活發(fā)揮抗炎作用，然而目前還缺乏證據證明其可改善腸道健康。本文擬研究在大鼠西式飲食中添加中國蜂膠提取物是否可以改善DSS誘導的結腸炎的病情，以及腸道菌群在這種保護機制中的起到的作用。
材料和方法
材料：6周齡185g左右的雄性大鼠。
實驗組：4組（每組8只），分別添加不同濃度（0％，0.1％，0.2％和0.3％）的中國蜂膠提取物喂食3周。僅在第2周內在飲用水中添加DSS（3％）。
對照組：5只，不添加DSS，只喂食西式飲食
測序平臺：MiSeq Illumina
分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud）
方法：
- DAI指數評估：第二周到第三周內基于體重變化，糞便性狀，腸血及綜合狀態(tài)來評估
2.組織鏡檢：3周后采集組織包埋染色，基于細胞浸潤和組織損傷程度進行評分。
3.短鏈脂肪酸(SCFA) 分析：去離子水稀釋盲腸消化物作內標，氣相色譜測定大鼠盲腸內容物中乙酸根，丁酸根，丙酸根，總SCFA含量。
4.腸道菌群分析：盲腸內容物提取DNA，擴增16S rRNA序列并測序組裝?；?7％的序列相似性將高質量標簽聚類成OTU進行分析，并進行α和β多樣性分析、主坐標分析（PCoA）、（LDA）效應大小分析。
研究結果：
- ? 蜂膠對于結腸癥狀的影響
實驗組每日記錄DAI數據。DSS的加入后，DAI顯著增大（p <0.001）。對照組DAI為零。0.3％蜂膠添加顯著降低了DAI（p <0.01或p <0.001）（圖1a?D6至D9）。DSS治療期間，喂食0.1％蜂膠的大鼠體重增加顯著低于對照組，但0.2％和0.3％的蜂膠添加不改變大鼠的體重增加。最后實驗組和對照組體重沒有顯著差異（圖1b），肝，脾，腎等器官和脂肪重量也沒有顯著差異（表1）。然而0.3％蜂膠喂養(yǎng)的大鼠比對照組結腸長度/重量比更大（圖1c，p <0.05）。
DSS處理組的組織學鏡檢觀察到嚴重的粘膜炎癥（如潰瘍，水腫，隱窩損傷和腸上皮浸潤）。與0％蜂膠組中大鼠相比，0.3％蜂膠減少了DSS誘導的結腸炎的組織學癥狀（圖1d）。
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表1.器官及脂肪重量?
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圖1蜂膠添加對DSS誘導的結腸炎嚴重程度的影響。（a）實驗期間的疾病活動指數（DAI）; （b）實驗結束時的體重增加;（c）實驗結束時結腸長度/重量比; （d）0％蜂膠組，0.3％蜂膠組、對照組的HE切片;（e）大鼠組織學評分（0為無炎癥，6為最大組織損傷和細胞浸潤）
2. ?蜂膠對SCFA水平的影響
與0.1％蜂膠組相比，0.2％蜂膠組盲腸中乙酸鹽和總SCFA低。沒有觀察到其他SCFA水平的差異。盲腸組織重量，食糜重量和pH值不受蜂膠處理的影響。
3. ?蜂膠改變結腸炎大鼠腸道菌群結構
16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育比較0％蜂膠，0.3％蜂膠和非DSS處理組的微生物群體。測序后得到平均37,362（20,793-51,692）個有效標簽。具有至少97％相似性的序列聚類為操作分類單元（OTU）。Shannon指數表明微生物群落的α多樣性，DSS處理組顯著降低，蜂膠顯著增加微生物多樣性（p <0.05，圖2a）。根據對照組，0％蜂膠組，0.3％蜂膠組三組間加權UniFrac距離評估微生物群落，結果顯示補充蜂膠使微生物β多樣性具有顯著差異（p <0.001，圖2b）。此外進行加權PCoA分析研究腸道菌群結構，發(fā)現(xiàn)蜂膠和DSS能調節(jié)腸道菌群（圖2c）。（圖2d）三組重疊OTU數據的維恩圖表明在所有樣本中，共1405個OTU中有722個是所有樣本共有的。而0.3％蜂膠組的440個OTU與另外兩組不同。在門水平，0％蜂膠組和對照組中以厚壁菌門和類桿菌門為主，其它門占比較少。但0.3％蜂膠處理組（圖2e）中這兩個門的微生物比例要小得多，而變形桿菌，酸桿菌和其他微生物占比較高
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圖2 蜂膠改變了結腸炎大鼠腸道微生物的組成。16S rRNA測序檢測對照組，0％蜂膠和0.3％蜂膠組盲腸消化物微生物群。（a）Shannon多樣性指數分析α多樣性，兩組間顯著性差異* p <0.05，** p <0.01;（b）加權UniFrac距離分析組間的β多樣性。兩組間顯著性差異***p<0.001; （c）基于未加權的UniFrac分析得到腸道微生物群的PCoA圖；（d）OTUs的維恩圖顯示三組菌群差異；（e）門水平優(yōu)勢菌群的相對豐度
4. ?蜂膠改變結腸炎大鼠中腸道菌群的主要模式
為了鑒定與蜂膠處理減輕結腸炎癥狀相關的特定細菌類群，進行LEfSe分析比較腸道微生物群（圖3）。在對照組，DSS（0％蜂膠）和0.3％蜂膠組（LDA閾值log 10> 4.0）中，共有13個類別的菌在相對豐度上有顯著差異。對照組大鼠顯示更高豐度的細菌類桿菌，以及較低豐度的分類乳酸桿菌，乳酸桿菌科和乳酸桿菌。 DSS（0％蜂膠）組顯示潛在病原菌豐度增加，如類桿菌和瘤胃菌科。在門水平0.3％的蜂膠導致綠彎菌門，變形菌，芽單胞菌門增多。在綱水平0.3％蜂膠添加顯著增加了β-變形菌和芽單胞菌門的水平。另外芽單胞菌目、黃單胞菌目、以及較低類群芽單胞菌科和黃單胞菌科的相對豐度顯著增加。
科學院蜜蜂研究所王凱-文獻解析2889.png)
圖3.LEfSe分析微生物群落組成特征。從16S rRNA序列LEfSe分析得到的分類進化分支圖。 紅色表示0.3％蜂膠組; 綠色表示0％蜂膠組，藍色表示對照組
結論：
本研究表明在膳食中補充中國蜂膠可減輕大鼠DSS誘導的結腸炎的癥狀。與對照組相比，0.3％濃度蜂膠添加組能顯著改善結腸炎癥狀：更低的DAI（p <0.001），顯著增加的結腸長度/重量比（p<0.05）及改善的遠端結腸組織結構。盡管添加蜂膠沒改變消化物中SCFA濃度，但16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育測序結果顯示，0.3％蜂膠添加組與對照相比，21天后腸道微生物（包括變形菌門和酸桿菌門的細菌）多樣性顯著增加。
創(chuàng)新點
這是第一個證明膳食中添加蜂膠可改善DSS誘導的結腸炎的研究，提供了研究炎性腸病中膳食微生物菌群相互作用的新思路，也揭示了蜂膠用于治療IBD中的巨大潛力。
參考文獻
Wang K, Tian W L, Wu L, et al. Dietary Propolis Ameliorates Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis and Modulates the Gut Microbiota in Rats Fed a Western Diet. [J]. Nutrients, 2017, 9(8).
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